线粒体自噬在SODI转基因小鼠中研究（可编辑）

线粒体自噬在SODI转基因小鼠中研究（可编辑） 线粒体自噬在SODI转基因小鼠中研究 河北医科大学 学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试 验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应法律责任。 研究生签名:历獗 导师签章:雾嘿鸯蓦级学院领导盖章: 年多 11 二p 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名: 导师签章: 掀 勒 壤(篓 。，1 V年夕月呷日 ,,煳黜 目 录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„l 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 研究论文线粒体自噬在SODl转基因小鼠中的研究( 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7日lJ舌„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„’7 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„13 附图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 综述自噬和线粒体自噬„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„40 个人简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„41 中文摘要 线粒体自噬在SODl转基因小鼠中的研究 摘 要 1ateral 目的:肌萎缩侧索硬化 缸nyo仃ophic 进行性加重的神经系统变性疾病，累及上下运动神经元，主要临床表现为 进行性加重的肌肉萎缩、肌无力，其感觉系统一般不受累，缺乏有效的治 疗方法，病人常在发病后3(5年因呼吸肌麻痹而死亡。90,,95,的ALS 为散发性，5,,10,的ALS为家族性，其中约20,的家族性肌萎缩侧索 的发病机制尚不清楚，可能是多元的，包括氧化应激、谷氨酸兴奋毒性、 线粒体功能障碍、异常的蛋白质聚集、轴索运输障碍和凋亡等。近年来线 粒体功能障碍在ALS的发生发展中所起的作用越来越受到人们的重视。 线粒体是细胞内最重要细胞器之一，提供细胞生存所需能量，传递细胞信 息，介导细胞凋亡，调节钙离子浓度等。运动神经元的线粒体功能是否正 常至关重要。 在生理条件下，机体可以通过自噬途径清除异常的蛋白质和受损的细 胞器，如线粒体、内质网、过氧化物酶体等，以实现细胞器的更新，维持 细胞稳态，保持旺盛的生理状态，自噬障碍可导致很多神经变性病，过多 的或过少的自噬都是有害的。线粒体经自噬途径被选择性的清除，即线粒 体自噬。线粒体不断的进行增殖和自噬，来维持线粒体的正常形态、数目 chain 和功能等。LC3II Microtubule―aSsociatedprotein1light 3(II，LC3II 特异地参与自噬泡形成，被认为是自噬泡的“标志物”。P62是一种LC3,A坦8 连接蛋白，在自噬过程中绝大多数被清除，常被人们作为自噬途径通畅与 否的标志物。有研究报道自噬相关基因7 Aut叩hagy―relatedgene7，A瞎7 缺陷的小鼠骨骼肌中出现线粒体肿胀、嵴断裂、呼吸链活性下降等。在 ALS中，人们也已发现:线粒体嵴断裂、消失、空泡化、呼吸链活性下降 等改变。那么，ALS中线粒体自噬是否存在障碍，这和SODl蓄积是否存 在相关性，仍需进一步研究。 SODl(G93A转基因小鼠是目前研究ALS最为理想的动物模型之一。 本实验旨在研究线粒体自噬在SODl(G93A转基因小鼠中的情况，探讨其 中文摘要 在ALS的发生和发展中所起的作用。 方法:选取SODl(G93A转基因雌性小鼠为实验组，根据病程分为60 天组、症状早期组、终末期组，选取90天的雌性阴性小鼠作为对照组，各 髓迅速投入液氮冷冻，之后保存于(80?冰箱;采用Percoll密度梯度离 心法分离得到小鼠脊髓线粒体组分和去线粒体胞浆组分;4,多聚甲醛经 心脏灌注，之后剥离小鼠腰髓，用4,多聚甲醛浸泡或用2(5,戊二醛固定 组织。利用电镜技术、W(estem 转基因小鼠腰髓运动神经元的形态并 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 LC3II和P62在小鼠腰髓各组分 中的含量。 结果: 和终末期组较对照组增加，60天组较对照组无明显变化。利用激光共聚 基因小鼠腰髓前角细胞形态学变化:利用电镜我们观察到，症状早期组及 天组和阴性对照组无明显空泡。‘ 度梯度离心法分离得到线粒体组分和去线粒体胞浆组分，利用W，estem blot技术分别检测两组分中LC3II的蛋白含量，发现症状早期组和终末期 组线粒体组分中LC3II的含量较对照组明显增多，去线粒体胞浆组分中 共定位增加。 粒体，利用W-estem blot技术检测线粒体组分中P62含量，发现随着疾病 的进展，症状早期组和终末期组P62的含量较阴性对照组明显增加，60 天组较对照组无明显变化。 结论:通过对SODl(G93A转基因小鼠腰髓前角细胞的形态学观察及 中文摘要 的含量明显增加，去线粒体胞浆组分中LC3U的含量明显减少。这证实了 线粒体自噬在SODl(G93A转基因小鼠中存在障碍，过多的线粒体滞留在 线粒体自噬的早期阶段，成为ALS的始动环节或恶化因素。 关键词:肌萎缩侧索硬化;线粒体自噬;微管相关蛋白1轻链3;P62; SODl(G93A转基因小鼠 英文摘要 in 1 SOD mice Mitophagy transgenic ABSTRACT lateralsclerosis is a ObjectiVe:Anlyo仃叩hic ALS progressive andlo、?ermotor neurodegeneratiVe dise嬲e，a行eCtillgupper charaCterized limb、?e址 11ess龇ld muscle byprogressiVe a仃ophy，while 2ure ofe行ectiVe缸(ea:tIIlentandmostof senso搿systemsgenerallyspared(LaCk t11e dieof 3-5 1 at|er(ALScanbedividedin幻 patients respirato巧failureyears 伽nilial lateral forabout5,一lO, amyotrophicsclerosis ,ALS aCcounting a11d lateral forabout sporadicamyotrophic toitS alrld 90,一95,accordingspeciality of印isode 20,of龇S arecaused of patients by?lutationscopper一洳 cSuperoxide and ofALS now，tlle disHlul那e SOD1 gene(Untilaetiologypamogenesis remain ummo、 l，n(OxidatiVe s臼ess， la玛ely glutamateexcitoto 【ici劬 mitochondrial dysfhction，a_bnomalprote(m haVebeen t0 mits barriers，and apoptosis proVedparticipatepa吐109enesis( Recentthe in ofmitochondriaALSattraCtsmoreandmore yearsdys劬ction 醐[entions(Mitochondriaareoneofmemost impommt forcell m energy sulNival，participating calciumconcentration2Lrldsoon(Nomal 印optosis，regulating mnctioniscmcialf(ornlotorneurons( In canremoveaberrant conditions，me physiological o略anism proteins and damagedo玛anellesbyautophagy to mai蛐 oellular reticuluIn， endoplasmic peroxisomes， cell， update and homeo咖sis canleadto ke印itsphysiologicals切te(Inlpairedautophagy too加【uchortoolittle is m锄yneurodegenerativediseases，arld autophagy h锄m1(Mitochondriacanbe cleared selectiVely by roletomaintaill mitophagy(Mitophagyplays觚important no衄al mo印holo鼢肌mber 1 to bound proteinlightcha协3一?，LC3II isspecifically 4 英文摘要 ausa11 membr觚esaIldse?es marker servers觞a autophagicproteill(P62 betw(eenLC3IIandthe is bridge ubiquitm―conjugatedc撒葛o，wKchdeg? 耐ed in廿1e of oRentake markerof processautophagy，sopeople p62嬲a flux(Researchmatskeletalnmsclein 乱ltophagic reported A蟾7 allt叩ha斟 related miceshowedmitochon“a gene7，A鸩7 deficiem cham a11dsoon(111 haVealso broken，respiratoUaCtiV时declinedALS，people f(ouIldmitochondria andme respirat0巧 cristaIe矗agmentation，Vacuolization chain decreased(WhetherinALSis mere actiVity mitophagy inlpaired?Are relationbetween me ofmll切nt 17Its aCcunlulationSOD 甜ly mitoph姐拶锄d releVantarestin reports need如rther咖dy( poor，and At SOD miceareoneoft11emostideal present，thel―G93A仃ansgenic ALS wefocus models(Hereon inSOD mice，t0 mitophagy1一G93A扛ansgenic itsroleint11e ofALS( study pa廿109enesis Methods:Female micewereused懿tlle SODl一G93A饥msgenic animals(The90 controlsserved 嬲 experimental days’female wild勺，pe werefour cont|rol铲oup(Theregroups:contr(ol毋(0up，60-day―oldgroup， ollset twelVemice(After stage目(oup甜ldendingstage目(01-lp(Each目(oup协cluded l O,hydrationaldehydes 350mg,I噜body the1umbarCordof anesthesia，decapitated，ex仃acted spinal arld werefi(ozeni11 andstored at一80?;isolated mey liquidIli仃ogen SpiIlal cord and withoutmitochondria mitochondria c”oplasm usillgpercolldensity fixatedtissuesViaheart 4, cenl ri如ga，tion; by 铲adient per如sion lumbarcordofmiceand做ated廿:伧min paraformaldehyde，dissectedspmal or electron 4,parafomaldehyde2(5,glutaraldehyde(Us协gmicroscopy’ westemblotandconfocal todetectme microscopy mo印hology;廿leprotehl ofLC3IIand inmitochondriaand wimout expression p62 cytoplasm mitochondria( Results: 1(The leVelsofLC3IIint11elumbar cordofALSmice: protein spinal westem ofLC3IIincreaseatt11e the onset blot，、?find usmg prote访leVels and withWTmice(ThereisnoobVious endingstage stage compared 5 英文摘要 di行erencebe铆eent11e andcon们l Confocal 60―day-oldgroup group( showst11atLC3IIimmunofluorescence tI胍simoa of microscopy population labeledMNsattheonsetand 2 of puIlcta证SMl3 endingstagesALS，、 l 加le LC3IIimmunofluorescencedistributed inthe lightly homogeneously ofMD叮sin?Tmiceand60dALSmice(The cytoplasm mo巾 hological inmelul】曲ar cordMNsofSOD changes spinal mice: uSing 1一G93A仃ansgenic electl(on findmerearealotof inmeMNsat microscopy’we autophagosomes nleonsetand of n0accurllulation of ALS，、池ile endingst2唱e attlle a11d 60-day―oldgroup( control伊oup 2(111e levelsofLC3II证isolatedmitochon“aa11d proteill cytoplasm w曲out mitochon越awestemb10t:tlle leVelsofLC3Hm by proteill mitochon Iriaincreaseatt11eonsetand it ofALS mice，、? _11ile endingstages decreasedin double ofLC3II c”oplasm晰t110utmitochondria(Bystainings and mitochon“amarker findVDAC clugters VDAC，we immunopositive co一10calizedwim inMNs LC3 ofALSatt11eonset肌d II―positiVepuncta ofALS( ending stages 3(1he leVelsof mitochon“awestemblot:me protein p62洫isolated by leVelsof combinedwimmitochondriaincreaseatmeonsetand protein p62 ofALS isno differenceofme mice;t11ere endingstages significam proteill leVelsof combinedwithmitochon“abet、?eenWTmiceand60d p62 group ofALSmice( aIld Conclusions:Bymo印hologicalobse?ation，proteinquant鼢ion co―localization f(md:w“hme of obserVation，we ALS，me pro铲ess protein leVelsof inluI】凼ar cord LC3II levelsofLC3IIand spinalincrease;t11eprotein mmitochondria leVelsofLC3IIin p62 iIlcrease;t】b coInponent protein wimoutmitochondriadecrease(Thisindicates也at in cytoplasm m“ophagy SOD1 miceis mitochondriaatme transgellicinlpaired:excessiVestay early 0r of be det耐 oratiVefactIDrofALS( s切gemitophagy'whichmay me证itiating lateral Keywords:加nyo臼(opllic chain sociatedl mice proteillligm 3一II;P62;SODl一G93A仃ansgenic 6 研究论文 线粒体自噬在SODl转基因小鼠中的研究 -?‘--k 刖 吾 lateral 肌萎缩侧索硬化 Amyo仃ophic 病的致死性运动神经元退行性疾病，以肌肉无力、肌肉萎缩为主要特征。 ALS的病因和发病机制尚不清楚，可能是多元的，包括遗传、谷氨酸兴奋 毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集、凋亡、轴索运输 障碍和自身免疫等。线粒体是细胞内最重要的细胞器之一，提供细胞生存 所需能量，有细胞内“动力工厂"之称。线粒体极易受到氧自由基的攻击， 而且线粒体DNA较易损害。在ALS中，线粒体形态和功能等方面的异常已 经得到证实，如线粒体棘断裂、消失、空泡化、呼吸链活性下降、氧自由 基产生增加等。随着研究的深入，线粒体功能障碍在ALS的发生发展中所 起的作用越来越受到人们重视。 在生理条件下，机体可以通过自噬途径清除异常蛋白质和受损的细胞 器，如线粒体、内质网、过氧化物酶体等，以实现细胞器的更新，维持细 胞稳态，保持旺盛的生理状态【l】。受损的或老化的线粒体经自噬途径被选 择性的清除，即线粒体自噬。鉴于线粒体的重要性及其易损性，成功修复 线粒体显得尤为重要。线粒体自噬是自噬最有意义的分支之一，为线粒体 的质量控制保驾护航。LC3II特异的与自噬体膜结合，其含量与自噬体形 成密切相关，被认为是自噬泡的“标志物”【2，31。P62是需降解货物的受 体或 者说是自噬特异底物，通过与LC3II相互作用，在LC3?与目标货物的识 别中发挥作用。P62在自噬过程中绝大多数被清除，常被人们作为自噬途 径通畅与否的标志物降6】。正常的自噬功能对细胞内质量控制、维持细胞 稳态有重要作用，太多的或太少的自噬都是有害的。已有研究证明，无论 是在家族型肌萎缩侧索硬化中，还是在散发型肌萎缩侧索硬化中，自噬机 制都存在缺陷，自噬障碍已经成为ALS重要的病理机制f刀。但自噬障碍 在ALS模型鼠中的研究尚停留在初期阶段，要想弄清楚自噬，尤其是其 重要分支线粒体白噬在ALS模型鼠中的情况及其所起的作用，还需进行 大量研究。 研究论文 态表达，深入探索线粒体白噬在ALS发病过程中所起的作用。 材料与方法 l材料 1(1小鼠 早期组 约90-110天，即体重开始减轻、双下肢屈曲、出现步态异常 ， 终末组 约130-150天，即体重明显减轻、双下肢瘫痪、仰卧30秒内不能 翻正过来 ;选90‘天的雌性阴性小鼠作为对照组，均为B6S儿,F1背景。 各组12只，3只用于电镜观察， 3只用于腰髓总蛋白定量， 3只用于 提 取线粒体组分分析，3只用于激光共聚焦技术观察。操作过程 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，符合 N【H指南。 1(2主要试剂及购买 试剂名称 公司 总蛋白提取试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司 ?PA裂解液 北京普利莱基因技术有限公司 PVDF膜 Millipore 公司 BCA蛋白测定试剂盒 Novagen公司 预染蛋白标准 Fememas公司 十二烷基磺酸钠 SDS 德国Serva公司 甘氨酸 德国Se?a公司 三羟甲基氨基甲烷 ,s 美国妇 sco公司 LC3抗体 美国Sigma公司 P62抗体 美国Sigma公司 Cox(1抗体 美国santa公 司 VDAC抗体 英国Abcom公司 p(actm抗体 美国 Santa公司 封片液 北京普利莱基因技术有限公司 其它试剂 国产分析纯 研究论文 1(3溶液配制 双蒸水中，加热至37?溶解，补双蒸水至终体积为looIIll，置棕色瓶中保 存。 l 1 Sulfate，SDS :SDS 0,十二烷基硫酸钠 Sodi啪Dedecyl 09，溶 于looml双蒸水中，加热到68?溶解，4?保存。 1 O,过硫酸铵 AmmoniumPersul蠡lte，APS :过硫酸胺1 g，溶于 终 体积为10ml的双蒸水中，4?可保存14d。 5×上样缓冲液:1M嘶s―HCl pH6(8 1(25ml，SDSO(59，溴酚兰25mg， B(巯基乙醇25“l。 电泳缓冲液:5×贮备液:甘氨酸479，Tris7(559，加双蒸水至500ml; 10ml，加双蒸水至1000ml。 1×工作液:5×贮备液190ml，10,SDS 转膜缓冲液:10×贮备液:甘氨酸14(59，而s299，SDS1(859，加双 1000ml。 ml，30,丙烯酰胺1(O 5,浓缩胶 6m1 :lmo儿嘶s―HCl pH6(8 O(75 ml，10,SDS ml，10,APS 60“l，蒸馏水4(12 60山，TE?匝D6“l。 mol,L啊s-HCl ml，30,丙烯酰胺 lO,分离胶 10 8(8 3(75 IIll :1 0H 3-3 loo ml，10,SDS ml，10,APS IrLl，蒸馏水2(75 100?l，TE姬D4?l。 封闭液、一抗稀释液:5,脱脂奶粉 用O(Olmo儿PBS配制 。 mo儿PBS250 Tween-20。 二抗稀释液、洗液:O(01 ml加入250“l HCl420 000 1M碱s(HCl:nis ml，加双蒸水至1 IIll，4? 121(149，1N 保存。 5(4 5×TBE:称取瞄s g和硼酸2(75g，用高压后的双蒸水充分溶解后， ml。 加入O(5 8(0 4 mol,LEDTA pH 100ml，微波1 min 充分 1(5,琼脂糖:称取1(59的琼脂糖加0(5×TBE 溶解，加50u1的Goldview染料。 4周 。 lOnM EDTA 钾 溶液:2(029 9 研究论文 4周 。 EDl’A 分离缓冲液:lOOml碱s,ED刚蔗糖储备液，加150ml4?水，调PH 值至7(4，加水至300IIll 冰上保存，当天制备 。 40,的Perc01l:24Hd 值至7(4，加水至60ml 当天配制，冰上保存 。 拌混匀，溶解 当天配制，冰上保存 。 1(4主要实验仪器、设备及耗材 超净工作台 江苏苏净集团 葡萄牙HANNA公司 ?9321型精密pH仪 电子分析天平 日本A&D公司 GBOX(腿全自动凝胶成像系统英国SYNGENE公司 5417R台式高速低温离心机 德国Eppendorf公司 5415D小型台式高速离心机 德国Eppendorf公司 美国BIO-TEK公司 Sylle唧一HT多功能酶标仪 微量移液器 德国Eppendorf公司 制冰机 日本SANYO公司 烤箱 美国Comg公司 96孔培养板测定浓度 美国Co咖公司 MDF(U32V型超低温冰箱 日本S触qYO公司 DYZ(22A型双恒定时电泳仪 北京市六一仪器厂 DWl2型电泳仪 北京市六一仪器厂 搅拌器 上海司乐仪器厂 微波炉 WG700CTL20II―K6 广东格兰仕集团有限公司 DK(600型温浴箱 上海精宏实验设备有 限公司 01ympus 镜 社 CMl850型冰冻切片机 德国LEICA公司 研究论文 超速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司 美国ProSciemific公司 DouIlce匀浆器 2方法 2(1电镜观察SODl(G93A转基因小鼠腰髓切片的细胞内形态变化 醛固定，约30min后，小鼠全身僵直，此时取小鼠腰髓，并用2(5,戊二 醛固定组织，然后经清洗，固定，脱水，干燥，镀膜后，在透射电镜下观 察细胞内形态变化。 2(2利用Westem 总蛋白水平 2(2(1腰髓总蛋白的提取 O,水合氯醛麻醉，去眼球放血处死，断头，在冰上迅速 实验动物经1 取出脊髓的腰膨大，放入液氮速冻后于(80?冰箱保存备用。取lOmg腰 组织匀浆液转移到1(5ml 两相中间为一层厚厚的蛋白膜，小心吸除上层相和大部分下层相，保留两 相中间的蛋白絮状物。敞开管口，室温空气干燥沉淀。加入200ul的蛋白 离心去处不溶物。保存于(70?冰箱备用。 2(2(2蛋白浓度测定 采用BCA试剂盒检测，以BSA为标准蛋白，用多功能酶标仪测OD 值做标准曲线，然后检测样本相应OD值，对照标准曲线得出样本蛋白浓 度。 2(2-3W-estem blot步骤 PH (8的 8 1 制胶:安装好制胶板，配置10,分离胶 依次加入lM 匀 ，加入胶板中，并用异丙醇压平。待分离胶凝固后，倒掉异丙醇， PH 加入5,浓缩胶 依次加入1M DW、10,APS和TE姬D，充分混匀 。插上梳子，待用。 bu髓r，再加入适量蛋白 根据所测蛋白浓度 2 EP管中加入5ulloading 研究论文 计算得出 ，loo?煮沸5min;4?12OoO转,min，离心1min。 3 电泳槽中加入电泳缓冲液，排出气泡后将已处理好的样品上样，并加 入蛋白预染标准品，即M列ker。先调电压为80v，待M珧er出现两个 条带时将电压调至100V，继续电泳直至溴酚兰染料到达分离胶底部。 4 根据分子量将所需分离胶剥离，做好标记后，放入转膜缓冲液中平衡 5 min;剪取与凝胶同样大小的P? F膜，在甲醇中浸泡2,3lIlin;滤 纸、海绵浸入转膜缓冲液中平衡15min;依次在转移夹中放置海绵、 三层滤纸、凝胶、P? F膜、三层滤纸和海绵 由负极到正极 ;4?条 h左右。 件下，转膜，恒流，300InA，2 5 取出PVDF膜，5,脱脂奶粉封闭1h;加入相应的一抗 LC3，1:1000; P62，1:500;p(aCtiIl 标记的二抗孵育，室温1 min。 In仔ared 6 用Odysseyhnaging 强度，并分析结果。 组分和去线粒体胞浆组分中的含量，并检测P62在线粒体组分中的含量。 2(3(1利用PercoU密度梯度法【8】提取小鼠脊髓线粒体组分和去线粒 体胞 浆组分。 断头法处死小鼠，快速冰上提取脊髓，剥除脊膜，称重剪碎，加入 次离心 30，700转，4?，5分钟 ，上层液体为去线粒体胞浆组分;下层 液 体与第一次离心剩余的液体放在一起，经洋地黄处理后轻轻的置于已准备 好的Percoll梯度 40,PercoU2(5湖在下层，19,PerColl2(5ml在上层 多的弃除上清，再加适量分离缓冲液，6900转4?，10分钟。底层片状 沉淀即为线粒体。用电镜验证所提线粒体成分，用细胞色素氧化酶，? AC 和p(aCtin检测所提线粒体组分、去线粒体胞浆组分的纯度。 研究论文 2(3(2提取去线粒体胞浆组分和线粒体组分的蛋白。 应用总蛋白提取试剂盒提取去线粒体胞浆组分蛋白，方法同上所述。 将提取后的线粒体组分转移至1(5mlEP管，加入对PA裂解液，置于冰上 30分钟，120009，4?离心20min，得到的上清即为线粒体蛋白。 2(3(3应用W(estemb10t技术检测LC3II在线粒体组分和去线粒体胞浆 组分 中的含量，并检测P62在线粒体组分中的含量。 2(4应用激光共聚焦技术观察自噬泡的标记物LC3II与神经元标记物 SMl32、线粒体的标记物? AC的共定位情况。 固定约30min，取小鼠腰髓，浸泡于4,多聚甲醛数日。LeicaCMl850冰冻 切片机切片，厚度为30uIIl。切片用O(01MPBS清洗，10分钟×3次。接下 (3,强tonX(100打孔约20分钟，之后用lO,马血清封闭1小时，来用O 再 PBS 洗3 PBS 次，之后避光浸于已加入相应二抗的96孔板中孵育1小时，再次O(01M 洗3次，蒸馏水中浸泡数秒钟，放于擦净的载玻片上，避光晾干，之后滴 FVlooO共聚焦显微镜观察。 一滴淬灭剂，封片。Olympus 2(5统计学分析 利用sPSS13(O软件进行统计分析。实验数据以均数土标准差表示。 多组间均数差异性比较采用单因素方差分析。P O(05即认为有统计学意 义。 结 果 1(随着疾病的进展，突变SODl(G93A转基因小鼠腰髓中自噬泡逐渐增 加。 1(1应用W(estemblot技术发现，在症状前期，小鼠腰髓中LC3II的含量 无明显改变，随着疾病的进展，自症状早期开始LC3II的含量开始增加。 终末期组与对照组相比有增加趋势，但是统计学上无明显差异 P O(05 Fig(1 。 1(2应用激光共聚焦技术我们发现，在症状早期和终末期，LC3II与SM32 共定位增加，并可见团块状聚集，对照组与60d组未见团块状聚集 F培2 。 1(3突变SODl(G93A转基因小鼠腰髓前角细胞形态学发生变化，出现大 量自噬泡:利用电子显微镜观察腰髓前角细胞，我们发现，症状早期和终 末期小鼠腰髓前角细胞中出现大量自噬泡聚集，对照组和60d组无明显空 泡聚集 Fig(3 。 2(线粒体组分与LC3?结合增多，去线粒体胞浆组分中LC3?含量减少。 2(1应用W色St锄b10t技术，我们发现:在症状早期组和终末期组，线粒 去线粒体胞浆组分中LC3II的含量减少，60天组、症状早期组、终末期 、 组与对照组相比均有统计学意义 P O(05 Fig(4 。 2(2应用激光共聚焦技术我们发现:在症状早期和终末期运动神经元中线 粒体标记物VDAC和自噬泡标记物LC3II的共定位增加，并可见两者的 团块状聚集 Fig(5 。 3(随着疾病进展，SODl转基因小鼠腰髓线粒体组分中P62含量逐渐增 加。 在症状早期组和终末期组，线粒体组分中P62的含量增加，与对照组 F嘻4 。 研究论文 附 图 WT 60d OnsetEnd A 褥嚣』’爱曩i爱鬣7礤?爱 LC3II 妙_’溯_?蚴，?―嘲――嘲 p―actin?―――知四――_幽麓警雀黧嬲黝燃嬲幽警幽彩 B C 薰 皇 翌 驾 耋 ’^，T eOd On曹?I End 翻_otIp ‘一-_?‘t(?，? W(estemblot of leVelsofLC3 t11elum Fig(1 analysisprotein II A in cordsof SOD1一G93A ofLC3 transgenicmice(QuantitatiVeanalysis to inthelumbarcordsofSOD1-G93A mice p―actin spinal transgenic O(05( 研究论文 LC3II SMl32 Me玛e ??圈 60d 一?圈 0111set ??? End 一?? Double ofLC3IIaIldS?32mWrandALSmiceatdi恐rent Fig(2 labeling indicateLC3II f(oci( stages(An(owheads positiVe A:WT B:60d C:Onset D:End 16 研究论文 motorneuronsofWTandALS EM ofthelumbaur cord spinal Fig(3 images lotofvacuoles证也e arldme mice(Therearea erlding 伊oup( 011set孕oup A:×15000;B:×20000;C:×15000;D:×12000 A Onset End 60d P62 哼?鬻-二谧_―?_ „“; ‘?糍》知砌 k’谥警 p(actin ?o，匆一“鬣?_譬黼o ，::40 缈一V一“”?„一’’+，一7:。册1。‘j。， j锡 coxl l―一”_‘嗍一7’:鬈: 笺乏烹麓 Lc3II 爹„磊。2:警。二，暑,_I舄鬣_-一 鬣 躺 c，Io黼 钠黼 蚋脚 呐 B '?? I × O 望 墨 孵 O _J -O-纛:O―皇玎m》一_爵_?丘 OnSetE扎d 耽盯 60d gr IUp 17 研究论文 C 一 i。 素 堑j 葛 ;;j ?一 、: ? ? ，’ _ 玉 __ ?一 _ ，， 孵 歹 i 良 舅 , ，i