西布曲明对herg钾电流的抑制作用_临床医学论文

西布曲明对herg钾电流的抑制作用_临床医学论文 西布曲明对hERG钾电流的抑制作用_临床医学论文 西布曲明对hERG钾电流的抑制作用_临床医学论文 作者:胡锐，李宝莉，刘继平，张晓双，袁秉祥 【摘要】 目的 研究西布曲明对高 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达hERG钾通道的HEK293细胞 hERG电流的影响。方法 构建高表达hERG钾通道的HEK293细胞系， 采用全细胞膜片钳技术观察西布曲明对hERG电流的影响。结果 西布 曲明3、10、30、100μmol/L对电流Iherg tail的抑制率分别为 (8.82?2.32)%、(26.7?5.78)%、(44.93?4.60)%、(85.22?3.37)%， IC50为32.66μmol/L(n=8);西布曲明在30,100μmol/L浓度范围 内，在膜电位分别为-10mV,+60mV(step)和0mV,+60mV(tail)时， ?-?曲线显著下移(n=8)。结论 西布曲明对hERG电流有显著的浓度 依赖性抑制作用，这可能是其导致QT间期延长的主要作用机制。 【关键词】 西布曲明;hERG钾通道;QT间期 ABSTRACT: Objective To study the effects of sibutramine on the human ether a go go related gene (hERG) current in HEK293 cell line that overexpresses hERG potassium channels. Methods HEK293 cell line that overexpresses hERG potassium channels was constructed. Whole cell patch clamp techniques were employed to investigate the effects of sibutratime on Iherg in the cell line. Results Sibutramine reduced hERG current in a concentration dependent manner: the inhibition rate was (8.82?2.32)%, (26.7?5.78)%, (44.93?4.60)% and (85.22?3.37)% at the dose of 3, 10, 30 and 100μmol/L. IC50 value was 32.66μmol/L (n=8). ?-? relationship was inhibited by sibutramine (3, 10, 30 and 100μmol/L) at membrane potentials from -10mV to +60mV (step) and from 0mV to +60mV (tail) (n=8). Conclusion Sibutramine significantly inhibited Iherg in HEK293 cell line that overexpresses hERG potassium channels in a concentration dependent manner, which may be a major mechanism of causing QT interval prolongation. KEY WORDS: sibutramine; hERG potassium channel; QT interval 西布曲明(sibutramine)是中枢性减肥药物，临床用于治疗单纯性肥胖或肥胖合并2型糖尿病、高脂血症以及高血压。由于该药物疗效可靠、不良反应较小，故临床广泛应用。近年来国外文献报道西布曲明能引起QT间期延长及相关心律失常[1]，国内尚未见该不良反应的报道。快速激活延迟整流钾通道(rapidly activating component of delayed rectifier potassium channels, Kr)由hERG(human ether a go go related gene)基因编码，快速激活延迟整流钾电流(IKr)为心室肌细胞动作电位3相复极中的主要外向电流，在人心肌动作电位正常复极中起关键作用。目前认为，药物引起QT间期延长主要是由于心肌细胞外向复极钾电流减小引起。本研究采用全细胞膜片钳技术，通过观察西布曲明对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流的影响，为西布曲明导致QT间期延长的不良反应提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和细胞株 质粒hERG/pcDNA3为Dr. ROBERTSON G(University of Wisconsin Madison, WI, USA)惠赠。细胞采用HEK293细胞株。 1.1.2 主要试剂 盐酸西布曲明购自TOCRIS bioscience, UK;G418 (Sigma Aldrich, St Louis，MO, USA);细胞转染试剂盒Lipofectamine 2000TM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。Tyrode s溶液成分(mmol/L):NaCl 140，KCl 5.0，MgCl2 1.0，CaCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 5.0，Glucose 10，用NaOH调节pH值至7.4。电极内液成分(mmol/L):KCl 20, K aspartate 110，MgCl2 1.0，HEPES 10，EGTA 5.0，and GTP 0.1，Na2 phosphocreatine 5.0，Mg2 ATP 5.0，用NaOH调节pH值至7.2。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养和基因转染 按Lipofectamine 2000TM试剂盒说明严格操作，将hERG/pcDNA3质粒转染入HEK293细胞，用含有200g/L G418的DMEM(Dulbecco s modified eagle s medium, Invitrogen) 筛选出稳定表达hERG通道的细胞系，DMEM中加入100mL/L胎牛血清，细胞置于50mL/L CO2、37?培养箱中培养。 1.2.2 电生理 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 细胞爬片培养24,48h后，将盖玻片放置于容积为1mL的灌流槽中，置于倒置显微镜(Olympus FV300;Tokyo, Japan)载物台上。采用全细胞膜片钳技术，在电压钳模式下记录电流。硼硅玻璃电极(直径1.2mm)经横式微电极拉制仪(P 97, Sutter instrument Co.,Novato, CA)分两步拉制，充灌电极内液后阻抗为2,3MΩ。电极与膜片钳放大器连接(EPC10 amplifier, Heka, Lambrecht, Germany)，放大器由计算机控制，刺激产生和信号采集采用 Pulse(HEKA, Lambrecht, Germany)软件。高阻封接(>1GΩ)后负压破膜，调节慢电容和串联电阻补偿，形成全细胞记录模式进行实验，观察不同浓度(3、10、30、100μmol/L)西布曲明对hERG时间依赖电流(Istep)和尾电流(Itail)的影响。 1.3 实验数据处理及分析 实验数据采用PCLAMP 9.0 软件(Axon Instruments)进行处理，以SPSS10.0软件处理数据，Sigmaplot 10.0软件作图，实验数据用?s表示，两组比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学处理，0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 西布曲明对hERG钾电流的抑制作用 施予+20mV、持续时间2000ms的去极化脉冲，可记录到时间依赖性外向电流IhERG step，复极至-50mV时，持续时间5000ms，记录到尾电流IhERG tail，测量IhERG tail的最大幅值(图1A)。西布曲明3、10、30、100μmol/L对IhERG tail电流最大幅值的抑制率分别为 (8.82?2.32)%、(26.7?5.78)%、(44.93?4.60)%、(85.22?3.37)%， 经Hill方程拟合，得到IC50(50%抑制浓度)为32.66μmol/L(n=8)(图1B、图1C)。 2.2 西布曲明对hERG 钾电流?-?曲线的影响 施予-60mV,+60mV、阶跃10mV、持续时间2000ms的去极化脉冲，可记录到时间依赖性外向电流IhERG step，复极至-50mV时，持续时间5000ms，记录到尾电流IhERG tail(图2A)，分别测量脉冲末端的电流幅值IhERG step和IhERG tail的最大幅值，并以各相对电流幅值对 应除极化膜电位作图，分别得到IhERG tail(图2B)和IhERG step的标准化?-?曲线(图2C)。西布曲明在30,100μmol/L浓度范围内，在膜电位分别为-10mV,+60mV和0mV,+60mV范围内明显降低IhERG tail和IhERG step的幅值，?-?曲线显著下移(n=8, 0.05或0.01)。 3 讨 论 西布曲明化学结构为β 苯基乙胺，通过肝脏细胞色素酶P450系统代谢，代谢产物能抑制去甲肾上腺素和5 羟色胺(5 HT)再摄取，从而抑制食欲、增加饱感;同时也增加中枢交感传出神经的兴奋性，进而兴奋β 肾上腺素受体，增加脂肪组织的葡萄糖利用和产热作用，增加能量消耗，使体重降低[2]。常见不良反应有头痛、口干、焦虑、失眠和便秘[3]。西布曲明不增加5 HT的释放，没有成瘾性，也不引起肺动脉高压和瓣膜型心脏病。但近年来国外相继有西布曲明导致血压升高、心律失常、胸痛、中风及视力障碍(诸如眼痛及眼底出血)等不良反应的报道[3]。 hERG基因最初是在人类海马的cDNA文库中发现的，是EAG(ether a go go)钾通道家族中的一员，在心肌组织中高度表达[4]。心室肌细胞的复极主要取决于钾离子外流，其中主要的电流之一就是延迟整流钾电流，包括快速与缓慢激活成分。目前普遍认为药物引起QT间期延长主要是由于心肌细胞外向复极钾电流的幅度减小。快速激活延迟整流钾电流(Ikr)是心室肌细胞动作电位复极3相中的主要外向电流，在人心肌动作电位正常复极中起关键作用。经证实Ikr是由hERG基因编码的[5 6]。 本研究首次观察到西布曲明对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流有显著的抑制作用，该作用呈浓度依赖性，可能是其导致QT间期延长及其相关心律失常的主要原因。鉴于QT间期延长严重时可导致发作性晕厥，甚至心源性猝死，故在临床使用中该不良反应值得进一步研究和关注。 致谢:感谢香港大学李贵荣教授对本实验的指导。 【参考文献】 [1]HARRISON WOOLRYCH M, CLARK DW, HILL GR, et al. 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