变性梯度凝胶电泳技术及其在食品微生物研究中的应用（可编辑）

变性梯度凝胶电泳技术及其在食品微生物研究中的应用（可编辑） 2009, Vol. 30, No. 11 食品科学 ※专题论述266 变性梯度凝胶电泳技术及其在食品微生物 研究中的应用 刘 灿 1,生吉萍 1,申 琳 1,2,* 1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.新疆农业大学食品科学学院,新疆 乌鲁木齐830052 摘要:食品中的很多微生物无法分离培养,传统的微生物研究方法不仅费时费力,而且会造成偏差。变性梯度 凝胶电泳denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE是一种不依赖于纯培养的分子技术,因其快速、灵敏、分 析全面等特点已被广泛应用于微生物生态学的研究中。本文介绍了 DGGE 的发展历程、原理、操作步骤及其在食 品微生物研究中的进展,评价了该技术的优势和局限性,展望了其在食品领域内的应用前景。 关键词:食品微生物;变性梯度凝胶电泳DGGE;微生物多样性 Review on Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Its Application in Food Microbiology LIU Can1,SHENG Ji-ping1,SHEN Lin1,2,* 1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing100083, China; 2. College of Food Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi830052, China Abstract:There are lots of unknown and “unculturable” microorganisms in food, but traditional microbiological methods not only are labor-intensive and time-consuming, but may cause deviation. Denaturing gradient gel electrophoresis DGGE is a cultural-independent molecular technique, and has been recently introduced into food microbial ecology. DGGE could easily identify the microorganisms from food, avoiding the potential deviation of traditional methods. This review summarized the development, concept, principle, operation procedure of DGGE and its application in food and food-related ecosystems. The limitation and application prospect of this approach in food microbiology were also discussed. Key words:food microorganism;denaturing gradient gel electrophoresis DGGE;microbial diversity 中图分类号:TS201.3文献标识码:A 文章编号:1002-6630200911-0266-07 收稿日期:2008-12-19 基金项目:国家公益性行业农业科研专项项目200803033 作者简介:刘灿1988-,女,硕士研究生,主要从事食品生物技术研究。 E-mail:liucan88723@126 * 通讯作者:申琳1964-,男,副教授,主要从事果蔬采后病理与农副产品资 源综合利用研究。 E-mail:shen5000@gmail 微生物是食品发酵的基础,传统的食品微生物研究 方法是分离、纯培养发酵食品中的微生物,对其计数, 然后用分类学和种系发育学的方法来鉴定其中的优势 菌。人们已经从玉米发酵米面团 [ 1 ]、发酵木薯淀粉 [ 2 ]、 乳酪[3]和酒[4]等发酵食品中分离培养得到了酵母、乳酸菌 和肠细菌等多种微生物。但是,天然环境中有 8 5 %~ 99% 的微生物至今还不可培养[5],只有不到 1% 的微生物 能够被分离培养出来[6],很多自然发酵的食品中生长的 微生物菌群仍然未知或无法纯培养。为了进一步了解发 酵食品的微生物生态,需要知道在发酵过程中微生物的 种群多样性、群落结构变化以及各时期生理活跃的微生 物菌种,但是传统的微生物分研究方法无法全面了解环 境中微生物的多样性。 变性梯度凝胶电泳 d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e l electrophoresis,DGGE是一种不依赖于培养的微生物分 子生态学技术[7],由 Fischer 和 Lerman 于 1979 年最先提 出,可以检测到一个核苷酸水平的差异 [ 8 ]。1 9 8 5 年, Myers 等[9]首次在 DGGE 中使用“GC clamp”和异源双 链技术,进一步完善了 DGGE 方法,并首次将 DGGE 技 术应用于研究菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样 性,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样 性和种群差异方面具有独特的优越性[10]。近 10 多年来, D G G E 已广泛应用于水体、根际、土壤、动物消化道 和食品等多种环境微生态的研究。在食品微生物生态学 267※专题论述 食品科学 2009, Vol. 30, No. 11 的研究中,DGGE 技术有助于全面了解食品中的微生物 群落及生理活性,以便于提高食品的质量,并控制其 微生物安全性。 1 DGGE 的原理 rRNA是细菌分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常 用的分子 [ 1 1 ],其中原核生物有 1 6 S、2 3 S 和 5 S 三种 rRNA,真核生物有 5.8S、18S、28S 和 5S 四种 rRNA。 原核生物的 16S rRNA 记载了微生物遗传进化的信息,既 有保守性又有可变性,且分子量集中,被广泛应用于 微生物的鉴定[12]。利用 16S rRNA 可变区侧翼的保守区 序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物,将 16Sr RNA 进行 RT-PCR 扩增或对 16S rDNA 进行 PCR 扩增,产生长度相同但序列不同的 DNA 片段混合物,然后通过 DGGE 将可变区序列不同的 DNA 片断分离,从而将不同菌属、菌种的细菌分离。因此, 这两项技术的结合被称作 PCR-DGGE 技术。 在 PCR-DGGE 扩增中,通常在其中一个引物的 5’ 端加上一段长为 30~50bp 的富含 G、C 碱基的“GC- clamp”,经过 PCR 扩增,富含 GC 核苷酸序列就附加 到双链的一端,形成一个人工高温解链区,其作用是 调节目的序列的解链行为,防止 D N A 片段完全解链, 从而使有一个碱基差别的 DNA 片段都可被分开[9] 。 图1PCR-DGGE分析样品示意图[14] Fig.1Working drawing of PCR-DGGE used for sample analysis GC 夹 变 性 剂 浓 度 增 加 电 泳 方 向 R A E R M S R 泳时间、电压等,有一个碱基差异的 DNA 片段都可在 DGGE 中被分开。 根据 DGGE 变性梯度的方向与电泳方向是否一致, 可将DGGE分为垂直DGGE和平行DGGE[15]。垂直DGGE 的变性梯度方向与电泳方向垂直,在一定变性剂浓度范 围内电泳后 D N A 片断呈现“S”型曲线,可用于研究 DNA 片断合适的电泳温度以及变性剂梯度范围;平行 DGGE 的变性梯度方向与电泳方向一致,可同时分析多 个样品并且进一步优化样品的分离条件图 2。 当双链 DNA 分子在含梯度变性剂尿素、甲酰胺的 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,某一双链 DNA 序列迁 移到变性凝胶的一定位置并达到其解链温度,即开始部 分解链,其迁移速度随解链程度增大而减小,从而使 DNA 片段滞留于凝胶的某一位置。双链 DNA 分子中 A、 T 碱基之间有 2 个氢键,而 G、C 碱基之间有 3 个氢键 连接,因此 A、T 碱基对对变性剂的耐受性要低于 G、 C 碱基对[13]。序列不同的双链 DNA 分子由于这四种碱基 的组成和排列不同,因此具有不同的解链行为,从而 在变性梯度的凝胶上形成相互分开的带谱[14],如图 1 所 示。理论上如果足够优化电泳条件如变性剂梯度、电 2 PCR-DGGE 的操作流程 DGGE 技术分析微生物群落的主要操作流程通常包 括:1样品总 DNA 或 RNA 的提取;216S rDNA/RNA 片段的 PCR 扩增;3PCR 产物的 DGGE 分析;4DGGE 图谱的分析,纯化回收电泳条带再次扩增,测序并进 行序列比对分析图 3。 2.1 样品总 DNA 的提取 采用 PCR-DGGE 方法进行微生物检测时,首先要提 取样品中的 DNA。只有选择适宜的核酸提取方法才能 提高产率,更准确地反映微生物的实际群落构成。提 取 DNA 的方法有很多,采用氯苯法[16]成本低廉,适于 提取乳酸发酵物和堆肥细菌的 DNA。Frostegard 等[17]发 现超声波和冻融法结合可有效提取土壤 DNA。其他经 常见到的提取 DNA 的方法有珠磨法、试剂盒法等。环 境样品中尤其是堆肥和土壤中,腐殖质的存在严重影响 PCR 的扩增效率,可以用玻璃奶纯化法去除腐殖质,或 用稀释法[18],即将 DNA 稀释后再 PCR。 2.2 PCR 扩增 基于保守的基因片段如细菌中的 16S rRNA、真菌 中的 18S rRNA 或 26S rRNA 等的编码基因片段设计特异 性引物。目前在食品微生物研究中被广泛使用的细菌和 真菌的引物如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1,但是多组引物可获得更全面的实验 结 果 。 1 2 3 4 5 6 图2PCR 产物垂直 DGGEA与平行 DGGEB分离图谱[14] Fig.2Perpendicular DGGE A and parallel DGGE B patterns A B2009, Vol. 30, No. 11 食品科学 ※专题论述268 图 3 PCR-DGGE 应用于食品微生物检测的流程图 Fig. 3 Flow diagram of application of PCR-DGGE to analysis of food samples 食品或其他环境样品 DNA提取 基于rDNA不同区域PCR扩增 DGGE分析 已有探针 条带纯化 扩增测序 菌种系统发育分析 多种微生物的 DNA混合物 不同菌种长度相同序列 不同的DNA扩增产物 DGGE指纹图谱 在指纹图谱数据库 中直接分析 注:* 在上游引物的 5’端加上一个“GC-clamp”;细菌的引物以在 E.coli 中 的位置表示,真菌的引物以在 S.cerevisiae 中的位置表示;Δ温度范围 表示某些 PCR 扩增是以降落 PCR 的程序进行的。 表1食品微生物的 PCR-DGGE 分析中常用DNA扩增引物 Table 1PCR primers for DGGE analysis of DNA directly extacted from food microorganisms 适用的食品 菌名 扩增片断引物 引物序列 5 ’ - 3 ’ 退火温度Δ 参考 文献名称 起始位点 * 发酵香肠 Micrococcaceae, Enterococcus, 16 SV1 P1 41 GCG GCG TGC CTA ATA CAT GC 60~50? [19]Brochothrix thermosphacta, P2 111 TTC CCC ACG CGT TAC TCA CC 矿质水 Escherichia coli., Vibrio vulnificus 16S V1-V3 63f 63 CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC 53? [20]518r 518 ATT ACC GCG GCT GCT GG 乳制品 Lactobacillus 16S V1-V3 7f 27 AGA GTT TGA TC/TA/C TGG CTC AG 65~55? [21]Lab-0677r 659 CAC CGC TAC ACA TGG AG 木薯粉、 Lactobacillus Bifidobacterium, 338f 338 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 乳制品、 Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis 16S V3 矿质水 Streptoc occus sp., Enterococcus saccharolyticus 518r 518 ATT ACC GCG GCT GCT GG 65~55? [2]、[3]、[10]、[20] 发酵香肠、威士忌 Lactobacillus 16S V3 HDA1 338 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 56? [19]、[2] Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus HDA2 539 GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C 发酵面团 Lactobacillus, Pediococcus, 16S V3 L1 352 CAG CAG TAG GGA ATC TTC C 66? [23] Leuconostoc aureus, Klebsiella Weiss HDA2 539 GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C 发酵面团 Lactobacillus, Pediococcus, 16S V3-V4 Lac1 353 AGC AGT AGG GAA TCT TCC A 66? [23]Leuconostoc aureus, Klebsiella Weiss Lac2 651 ATT YCA CCG CTA CAC ATG 乳制品 lactic acid bacteria, enterococci, 16S V4-V5 Com1 519 CAG CAG CCG CGG TAA TAC 66~56? [24] Staphylococcus aureus Com2-Ph 907 CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT 香肠、乳酪 Lactic acid bacteria, 16S V6-V8 U968 968 AAC GCG AAG AAC CTT AC 60~50? [19]、[ 21]Staphylococcus aureus, Kocuria spp. L1401 1401 GCG TGT GTA CAA GAC CC 发酵香肠 Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, RPOB 1698f 1698 AAC ATC GGT TTG ATC AACLeuconostoc aureus, Klebsiella Weiss 2041r 2041 CGT TGC ATG TTG GTA CCC AT 58~52? [25] 发酵木薯粉 Eucarya 18S Euk1427F 1427 TCT GTG ATG CCC TTA GAT GTT CTG GG 65~55? [2]Euk1616r 1616 GCG GTG TGT ACA AAG GGC AGG G 酒 Yeast 26S NL1 63 GCC ATA TCA ATA AGC GGA 52? [26]LS2 266 ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC 269※专题论述 食品科学 2009, Vol. 30, No. 11 在 PCR 扩增中要同时保证扩增特异性和效率,所以 需要选择合适的引物、扩增程序来保证 P CR 产物的质 量,使所有模板以均等的几率被扩增,并且避免异源 双链和单链 DNA 等人工产物的形成。复杂的环境样品 采用降落 PCR 能够获得良好的特异条带。 2.3 DGGE及结果分析 如果 DGGE 的条带不清晰,可以将 PCR 产物用酒精 沉淀法浓缩后进样。梯度胶有双梯度和单梯度两种,双 梯度胶有变性剂和聚丙烯酰胺两个梯度,单梯度只有变 性剂一个梯度,采用双梯度法可以减缓条带的迁移,在 一定程度上提高分辨效果。变性剂梯度范围是由垂直变 性梯度凝胶电泳实验来确定,应选择电泳后“S ”型 曲线斜率较大的部分。电泳温度和时间是由平行变性梯 度凝胶电泳实验来确定的,通常在 60?左右进行优化。 核酸电泳后需要进行染色才能呈现出指纹图谱,最 常用染色方法是溴化乙锭染色法和银染法[27]。银染法是 通过银离子可与核酸形成稳定的复合物,再使用还原剂 如甲醛使银离子还原成银颗粒,可把核酸电泳带染成黑 褐色,其灵敏度比溴化乙锭EB高 200 倍,是目前最灵 敏的方法[28]。近年来,SYBR Gold、SYBR Green ?和 SYBR Green ?等[29]新一代荧光核酸凝胶染料被广泛应 用,这类染料的背景极低,可更好的观察电泳条带。 DGGE 指纹图谱包含了与多种微生物相对应的一系 列条带,应用多元变量的统计学方法对 DGGE 图谱用软 件进行分析,条带的数目、位置和强度可反映样品中 微生物种类的相对构成比例。将这些条带纯化回收 PCR 扩增用无 GC-clamp 的引物,然后测序并进行序列分 析,可鉴定微生物的种类。DGGE 图谱上的特殊条带测 序、16S rRNA 序列分析比对、荧光原位杂交和实时荧 光定量 PCR 与 DGGE 结合使用,能更好地分析微生物区 系组成。 3 PCR-DGGE 在食品微生物研究中的应用 3.1 鉴定从食品中分离出的微生物 3.1.1 发酵食品中细菌的组成 PCR-DGGE 技术在食品微生物研究中主要用于鉴定 发酵食品中的细菌。16S rDNA 的 V3 区常被作为靶基因 用 PCR-DGGE 来进行分离食品中的乳酸菌。2001 年, Ercol ini 等[30]用此方法鉴定了 34 株乳酸菌,结果发现 DGGE 图谱中一些普通的乳酸菌的菌种如 Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc lactis的条带不同,而一些亚种或者属于同一个种的菌 株用此方法不能被分离开,需要通过 16S rDNA、26S rDNA 以及 5S rDNA 的特异性扩增来鉴定。Cocolin 等[31] 鉴定了发酵香肠中的微球菌Micrococcaceae,分离出 了木糖葡糖球菌Staphylococcus xylosus、肉葡萄球菌 Staphylococcus carnosus和拟葡萄球菌Staphylococcus simulans三个菌株。Guerrini 等[32]通过对比 V3 区的扩增 产物与明串珠球菌Leuconostoc的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 条带的迁移度, 鉴定了几株意大利红酒中的葡糖苷酒球菌Oenococcus o e n i 。 但是,部分微生物种类无法根据 16SrDNA 的 V3 区 分离;为了提高 DGGE 的分离效率,部分研究同时扩增 16SrDNA 的多个可变区。Ercolini 等[24]依据 16SrDNA 的 V3区和V4-V5区同时进行PCR-DGGE分析斯蒂尔顿乳酪 中的微生物,鉴定得到乳酸乳球菌Lactococcus lactis、 粪肠球菌 E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s 、植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum、卷曲乳杆菌Lactobacillus c u r v a t u s 、肠系膜明串珠球菌 L e u c o n o s t o c mesenteroides和马胃金黄色葡萄球菌Staphylococcus equorum。Ercolini[33]依据从变性凝胶电泳上回收条带测 序得到的 D N A 序列设计了用于荧光原位杂交的探针, 鉴定了斯蒂尔顿乳酪中各个空间部位的微生物,发现乳 酪的中心、外壳下以及沿纹理的微生物对发酵起到不同 作 用 。 ropB 等基因编码 RNA 多聚酶β亚基,在各物种中 分布广泛、含有丰富的分类信息,也被用于菌种鉴定。 2004 年,Rantsiou 等[25]依据 ropB 基因鉴定了多种乳酸 菌,包括乳杆菌Lactobacillus、乳球菌Lactococcus、 肠球菌Enterococcus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和明串珠球菌Leuconostoc mesenteroides。 Cocolin 等[34]利用 iap 基因编码入侵相关蛋白的 PCR- DGGE 方法鉴定出五种里斯特氏菌L. monocytogenes、 L. innocua、L. welshimeri、L. seeligeri、L. ivanovii。 3.1.2 发酵食品中真菌的组成 Cocolin 等[4]基于酵母的 26S rDNA 的可变区进行 PCR-DGGE 分析来监控酵母菌群,在实验室小规模的发 酵酒中对酵母的检测底限达到 103CFU/ml,并至少可以 鉴定 4 种不同的酵母 Sce rev i s ia e、Me tsch n i ko wi a p u l c h e r r i m a、C a n d i d a e t h a n o l i c a、K l o e c k e r a apiculata。 3.2 监测食品发酵过程中菌相的变化 DGGE 能够同时分析多个样品,被广泛应用于对食 品微生物发酵过程中菌落数量和群落结构的动态监测。 Ampe 等[1]研究了墨西哥发酵玉米面团中的微生物的空间 分布及群落变化,将分离纯化得到的 DNA 片段测序来 鉴定乳杆菌Lactobacillus,结果表明,在整个发酵过 程中,乳酸菌占微生物总数的 9 0 % ~9 7 % ,链球菌 streptococcus占 25%~50%,植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、发酵乳杆菌Lactobacillus Fermentum和明2009, Vol. 30, No. 11 食品科学 ※专题论述270 串珠球菌Leuconostoc mesenteroides在某些时期也是优 势菌。Ben Oma 等[35]分析玉米面团发酵过程的菌群动力 学,研究表明链球菌属streptococcus是整个发酵过程 中的优势菌,2d 后好氧菌被产乳酸和乙醇的异型发酵乳 酸菌Lactobacillus Fermentum代替,随后异型发酵乳 酸菌又被同型发酵乳酸菌Lactobaci l lus plantarum, Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii所代 替;与此同时,酵母菌和其他一些霉菌在面团的外围开 始生长。Ampe 等[2]用同样的方法鉴定了酸木薯淀粉发酵 过程中的群落动力学变化,结果表明,乳酸菌是整个 发 酵 过 程 中 的 优 势 菌 , 主 要 包 括 双 歧 杆 菌 Bifidobacterium minimum、乳酸乳球菌Lactococcus l a c t i s 、链球菌 S t r e p t o c o c c u s s p、解糖肠球菌 E n t e r o c o c c u s s a c c h a r o l y t i c u s 和植物乳杆 菌 Lactobacillus plantarum。Ercolini 等[3]用 PCR-DGGE 分 析了各时期水牛莫泽雷勒干酪发酵剂中所含的微生物, 鉴 定 了 发 酵 过 程 中 有 四 种 乳 酸 菌 , 嗜 热 链 球 菌 Streptococcus thermophilus、乳酸乳球菌Lactococcus lactis、德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii和卷曲乳 杆菌Lactobacillus curvatus。 除 16S rDNA V3 区外,其他可变区也可用于监控 食品中的乳酸菌菌相变化。Randazzo 等[21]分别基于 16S rDNA的V6-V8区及V1-V3区针对于乳杆菌用PCR-DGGE 分析手工西西里奶酪发酵过程中微生物的动力学变化以 及 功 能 活 性 , 结 果 发 现 在 发 酵 初 期 嗜 温 乳 酸 菌 Leuconostoc、Lactococcus lac t i s、Macrococcus caseolyticus是优势菌,到达乳酸发酵阶段嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus占主导地位,后熟阶段其 他的耐热乳酸菌如德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii 和发酵乳杆菌Lactobacillus Fermentum成为优势菌。 Van Beek 等[22]研究了 Malt whisky 发酵过程中乳酸菌的 变化,对 16S rDNA的V3区和V6-V8区进行DGGE分析, 结果表明,在发酵早期嗜热链球菌 S t r e p t o c o c c u s thermophilus、乳酸短杆菌Lactobacillus brevis和发酵 乳酸杆菌Lactobacillus Fermentum起到重要作用,接 种酵母后发酵 40h 的时候乳杆菌迅速生长,在发酵后期 另外两种乳杆菌Lactobacillus acidophilus 和 Lactobacil- lus delbrueckii占主导地位。 同时采用培养后进行 PCR-DGGE 和不培养直接进行 PCR-DGGE 这两种方法来检测发酵食品中菌群的变化, 通过对比可以鉴定哪些微生物无法通过分离培养。 Miambei 等[36]用此方法检测木薯粉发酵过程中的微生物, 结果表明,直接 PCR-DGGE 的方法能够检测到 10 个菌 种,只有 5 个 L a c t o b a c i l l u s 、P e d i o c o c c u s 、 Clostridium、 Propionibacterium、Bacillus能够被培养 分离得到,从培养基中分离的菌种通过 PCR-DGGE 分析 可以分离出 18 个菌株;而有些乳杆菌L. manihotivorans、 L. fermentum、L. crispatus能够通过直接 PCR-DGGE的方法 检测到,却不能通过培养后 PCR-DGGE 的方法检测到,相 反,有些菌只能在培养后才能用 PCR-DGGE 的方法检测 到,这就说明了传统培养方法与 PCR-DGGE技术相结合在 食品中的微生物研究中的必要性。 PCR-DGGE 技术可用于检测食品发酵过程中真核微 生物多样性的变化。Cocolin等[37]基于26SrDNA进行PCR- DGGE 分析商业葡萄酒发酵过程中的酵母菌群落变化, 结果发现整个发酵过程中酿酒酵母都是优势菌。同年, Mills 等[38]用同样的方法检测受葡萄孢霉侵染的葡萄酒分 别在高温30?和低温20?下发酵过程中酵母菌的群落 变化,发现两种温度条件下的发酵过程中都有酿酒酵母 Saccharomyces、多形汉逊酵母Hanseniaspora、毕 赤酵母Pichia、甲基酵母Metschnikowia、克鲁维酵 母Kluyveromyces和念珠菌Candida;低温发酵过程 中包括念珠菌 C a n d i d a 的非酿酒酵母 n o n - Saccharomyces的酵母菌数量较多;在发酵后期优势菌 被酿酒酵母代替后克鲁维酵母Kluyveromyces仍然存活 很长时间;在高温发酵过程中有一株念珠菌Candida 106CFU/ml是优势菌,并且无法培养。Maro 等[39]用此 方法结合 RAPD-PCR 分析了意大利一个品种的白葡萄的 天然发酵过程中的酵母菌群落变化,检测到了 11 个菌属 的 18 个菌种,其中多形汉逊酵母、东方伊萨酵母和球 形假丝酵母在发酵的早期是优势菌,在发酵的中期和后 期酿酒酵母成为优势菌。 3.3 鉴定功能微生物和致病菌 用 PCR-DGGE 技术监测微生物群落变化,同时测定 各时期发酵食品当中相应物质的含量,可以鉴定在发酵 过程中起作用的功能菌。Cocolin 等[19]基于 16S rDNA V1 区的 D G G E 方法分析自然发酵的意大利腊肠,结果发 现,乳杆菌Lactobacillus sp.和微球菌Micrococcaceae 是在香肠发酵前期的优势菌, 3 d 后只有乳杆菌 Lactobacillus sp.是优势菌,清酒乳杆菌L. sake和弯曲 乳杆菌L. curvatus在产酸发酵和蛋白水解中起着重要作 用,决定了发酵香肠的感官特性。Nilica 等[40]等发现类 干酪乳酸菌是乳酪发酵过程中的优势菌,只有乳酸菌具 有蛋白水解功能,能够水解αs 1 - 和β- 酪蛋白。 D G G E 技术还可用于食源性致病微生物的快速检 测。Cocolin 等[34]通过对李斯特菌属的标准菌株特异 iap 基因入侵相关蛋白基因的保守序列进行 PCR-DGGE 分 析,鉴定出 5 种李斯特菌 L m o n o c y t o g e n e s、Linnocua、 L. welshimeri、L. seeligeri、L. ivanovii, 部分区分了单核增生李斯特菌的不同的血清型,外用该 方法成功鉴定出了 48 株从食品中分离得到的菌株和 73 株 未经培养的食源性里斯特菌株,建立了一种不经培养而 271※专题论述 食品科学 2009, Vol. 30, No. 11 直接检测和鉴定食品中李斯特菌属的分子生物学方法。 3.4 评价及控制食品质量 食品中微生物的指纹图谱是食品的一个基本特征, 已经被众多研究者用作评价和控制食品质量的一个重要依 据。Mauriello 等[41]用此技术分析了意大利南部不同地区 的水墨泽雷勒干酪的发酵剂,结果表明,发酵剂中乳酸 菌的种类与地理来源和凝乳过程中形成的风味物质都密切 相关。Russo 等[42]基于 16S rDNA 进行 PCR-DGGE 分析热 杀微杆菌对其他食品腐败菌的作用,结果表明,在 5? 冷 藏 牛 肉 中 引 起 腐 败 的 主 要 菌 种 是 热 杀 微 杆 菌 Brochothrix thermosphacta、假单胞菌Pseudomonas spp.、肠杆菌Enterobacteriaceae和乳酸菌;在 5?冷 藏的培养基中接种热杀微杆菌 B r o c h o t h r i x thermosphacta、乳酸菌和肠杆菌Enterobacteriaceae三 种菌的混合菌液后,无芽孢杆菌是优势菌,当乳酸菌开 始生长时热杀微杆菌的数量开始下降;了解食品腐败菌 之间的相互作用能够为提高冷藏新鲜肉的质量提供有了证 据。Randazzo 等[43]基于 16S rDNA 的 V6-V8 区进行 PCR- DGGE 分析了佩科利诺西西里乳酪发酵过程中的微生物变 化,这种传统的乳酪以生牛奶或巴氏消毒奶作为发酵剂 来生产乳酪,在整个发酵过程中牛链球菌和乳酸乳球菌 是优势菌,并且来自不同地区的乳酪中微生物的多样性 有很大差别,决定了不同地区的乳酪风味各不相同。 4 PCR-DGGE 的优势与局限性 DGGE 技术的最大优点是无需进行微生物培养。环 境中大部分微生物都不能通过传统方法培养,DGGE 是 通过核酸信息来描述微生物菌落的结构和特性。与传统 方法相比,DGGE 能够更快速、准确地鉴定环境中微生 物种群,描述微生物群落结构演替规律。 但是,D G G E 技术也有其自身的缺陷。首先,在 制样、样品处理过程中,清洗、混匀、冷冻或离心 等步骤会造成菌种改变或菌数变化。核酸提取更会导致 食品中一些微生物 D N A 丢失或不在超出检测限范围。 食品基质脂类、蛋白质、碳水化合物、盐类越复杂, 抽提就越困难,去杂就越不容易,而这些残存杂质很 可能会成为抑制剂影响 PCR 扩增[7]。 PCR 技术本身也存在不足,rDNA 基因在 PCR 过程 中对引物和酶等相互竞争,会产生优先扩增现象,只扩 增部分细菌的 DNA,造成了群落中原始成员的减少;另 外在 PCR 时会产生嵌合体或异源双链这些人工合成的基 因片段,它们都会影响 DGGE 图谱中条带的分布。 DGGE 的分辨率是有限的,它只能分离较小的片段 1kb 以下,这就限制了系统发育分析和探针的序列信息 量[44]。若选用的条件不适宜,DGGE 并不能保证可以将 所有的 D N A 片段完全分开,可能会出现不同序列的 DNA 共迁移的现象。另外有些细菌具有多操纵子,使 同一种菌的 DGGE 图谱上出现多条带,从而高估了样品 中微生物的多样性。 DGGE 具有一定的检测阈值,通常只能检测到优势 菌的存在,Muyzer[8]的研究表明,只有占整个群落细菌 数量约 1% 或以上的类群才能被检测到。在食品微生物 的研究中,该法的检测范围一般为 104~108CFU/ml[7]。 微生物群落的各个成员在 DNA 提取以及 PCR扩增时都会 相互竞争,从而影响目标菌的检测限。 5 展 望 近 10 年以来,DGGE 技术逐渐被应用到食品微生物 分子生态学研究中,目前已在鉴定和分离食品中的微生 物、评价发酵食品的微生物群落组成和动态变化和控制 食品质量等方面发挥出优势。食品中微生物 DGGE 图谱 的标准模型数据库的建立更有利于 DGGE 图谱的快速分 析。但是,单独使用 D G G E 电泳技术无法给出代谢活 性、细菌数量和基因表达水平方面的信息,需要结合其 它技术。DGGE 结合 Real-time PCR 可以准确地鉴定微生 物菌种,对群落的细菌数量和基因表达水平进行定量。 DGGE 与 Biolog 和酶学分析或荧光原位杂交技术结合可了 解群落代谢活性特征,了解群落结构和功能关系。 参考文献: [1] AMPE F, BEN OMAR N, MOIZAN C, et al. 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