首页 实验十一 细胞的原代培养

实验十一 细胞的原代培养

举报
开通vip

实验十一 细胞的原代培养实验十一细胞的原代培养 【实验目的】 1、掌握动物细胞原代培养的原理及其方法。 2、熟悉消化法培养和组织块培养法的基本操作步骤。 3、掌握原代培养中取材、消化及细胞无菌培养等基本实验操作技术。 【实验原理】 原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践,例如,用从手术中切除的...

实验十一  细胞的原代培养
实验十一细胞的原代培养 【实验目的】 1、掌握动物细胞原代培养的原理及其方法。 2、熟悉消化法培养和组织块培养法的基本操作步骤。 3、掌握原代培养中取材、消化及细胞无菌培养等基本实验操作技术。 【实验原理】 原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践,例如,用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养,然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选,根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案,有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。原代培养可分为消化法和组织块培养法,这里统一作介绍。 一、培养细胞生长的条件 1、细胞的营养需要 a、基本营养物质:氨基酸、维生素 b、促生长因子等物质 c、此外激素也可有助于细胞生长 培养液(medium):培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。血清(FBS,FCS,CS,HS)、合成培养基,如:DMEM、RPMI 1640和Ham F12等。 2、细胞的生存环境 a、温度: 适宜的温度与取材的动物种类有关 b、气相及pH: 5%CO2;pH: 7.2-7.4 。 3、无污染及无毒:无毒是培养细胞的必须条件,细菌,病毒,支原体等。 二、培养细胞的生长方式 1、贴附生长:必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 2、悬浮生长:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。各种造血系统肿瘤细胞 【器材与试剂】 1、器材:CO2培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、普通离心机、倒置相差显微镜、高压蒸汽消毒锅、除菌滤器、真空泵、解剖剪、解剖镊、培养瓶、培养皿、吸管、小烧杯、离心管、血球计数板、吸管橡皮头、酒精灯、试管架、废液缸、棉球。 2、材料:胎鼠或新生鼠。 3、试剂:1640培养液(含20%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶液、D-Hanks液、小牛血清、0.4% 1 的台盼蓝染液、双抗(青霉素和链霉素)、75%酒精、2%碘酒。 【实验步骤】 一、消化法培养的基本操作 1、操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手,手和临时带进无菌室的物品、工具等均用新洁尔灭浸泡消毒2分钟。 2、将胎鼠或新生鼠处死,然后用75%酒精浸泡消毒数秒,迅速带进入无菌室。 3、将胎鼠或新生鼠置超净工作台上,使其背部朝上,用碘酒棉球擦洗背部的被毛,然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。 4、在腰部的后缘,用解剖镊提起皮肤,用解剖剪剪开皮肤,用镊子将剪开的皮肤拉向两侧。用解剖剪剪开背部的肌肉,此时,即可见蚕豆状的肾脏,用镊子取出肾脏,放于无菌的已加入D-Hanks液的培养皿中。 5、用D-Hanks液洗涤肾脏,将肾外膜剪破,去肾外膜及脂肪,剪去肾盂部分,用D-Hanks 液洗涤肾脏,将洗过的肾脏转移至另一无菌培养皿中,用眼科剪将肾脏剪成1mm3的小块,组织块的大小要尽量一致。再用D-Hanks液漂洗二次,直到液体澄清。 6、将清洗过的D-Hanks液吸掉,按组织块的体积的5-6倍量加入0.25%的胰蛋白酶溶液,将其吸入无菌的离心管中,置于37℃水浴消化。消化时间在30分钟左右。每隔5分钟摇动一次,以便组织块分散开,以利继续消化,直至组织块变的松散,颜色略发白为止。 7、从水浴中取出离心管,将组织块连同胰蛋白酶液倒入一无菌培养皿中,加入一定量的含20%小牛血清的培养基,用吸管反复吹打,直到大部分组织块均分散成细胞悬液为止。 8、然后用吸管小心吸取悬液入离心管(注意不要吸入组织块),1000rpm离心5分钟。弃去上清液,在离心管中加入一定量的培养液,打匀后吸取少量的细胞悬液进行稀释(根据细胞悬液的浓度决定)、计数。 9、取一副血球计数板,进行细胞计数。悬液滴入计数室后,静止2~3分钟,待细胞在计数室中下沉后,再在低倍镜下观察计数。(数计数板四角的大方格内的细胞总数压在格子线上的细胞,根据“数上不数下,数左不数右”的原则进行计数。然后按下式计算:每毫升细胞悬液中的细胞数为:4大格中的细胞总数/4×104 *稀释倍数 10、将细胞悬液用培养液稀释至5×105/ml的细胞浓度,每个培养瓶装4ml培养液,盖好橡皮塞,放入37℃CO2培养箱中培养,直至细胞铺满。 二、组织块法培养的基本操作 (前5步操作同消化法培养) 6、用镊子将组织块移入培养瓶中,并均匀地分布在培养瓶内壁表面,翻转培养瓶,并在培养瓶内加入3毫升培养液,盖上培养瓶盖,放入37℃CO2培养箱中培养。 7、4小时后,再翻转培养瓶,将组织块浸入培养液中继续静止培养,直至细胞铺满。 【注意事项】 1、操作前,提前将操作间和超净工作台内紫外灯打开,消毒杀菌30 分钟。 2、进操作间前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 3、自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。 4、点燃酒精灯,操作在火焰附近进行。耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。 5、手不能在开盖的消毒物品上方活动,双手不能交叉取物。 6、操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。 7、不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。 8、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 9、吸溶液的吸管等不能混用。 10、在超净工作台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发或被污染。 11、凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入 【观察与结果】 1、组织块法培养细胞的观察培养24h后,倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来;48h后,可见大量的细胞放射状排列与组织块周围,这些细胞细胞核较大,细胞质内含物少,透明度高,彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小,较圆,离组织块较远的区域可见有多角形的细胞,体积较大,有些细胞的形态介于圆形与多角形之间。 2、胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下,可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形,悬浮于培养液中。24h后,大多数细胞已贴附于培养瓶底部,胞体伸展,重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。48h后,细胞开始增殖,细胞数量明显增多,在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞,这些细胞胞体轮廓通常较浅,因内含物少而较为透明。96h以后,新生的细胞将逐渐连接成片,胞体轮廓增强,核仁明显可见,透明度减弱。 3、观察和记录原代细胞的形态、培养细胞的贴壁时间、增殖时间、完全汇合时间。 【思考题】 观察原代培养细胞中的细胞类型,并根据以往的知识初步分析哪类细胞属于成纤维样细胞,哪类细胞属于上皮样细胞。
本文档为【实验十一 细胞的原代培养】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享,如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服,我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
下载需要: 免费 已有0 人下载
最新资料
资料动态
专题动态
is_624976
暂无简介~
格式:doc
大小:18KB
软件:Word
页数:0
分类:理学
上传时间:2019-09-11
浏览量:11