冠窦伪尾柱虫接合过程中小核的形态发生作用

冠窦伪尾柱虫接合过程中小核的形态发生作用 冠窦伪尾柱虫接合过程中小核的形态发生 作用 但原有纤毛器 多不从皮膜上消失;由于投有新核器形成,均不能启动第二扶形态发生并于拟包囊早期解体 死亡.因此,小核对 于维持接舍早期及第一次皮膜改组的正常进行具有某些明显作用,其衍生的大核原基对于 启动后续的发育则是 绝对必要的. 关键词腹毛类纤毛虫冠突伪尾柱虫小核有性生殖形态发生 纤毛虫细胞具有大核和小核.其小核在无性分 裂周期中执行某些体功能的现象,在多种纤毛虫的 研究中已积累了不少资料(Ng,1986;Takahashi, 1988;Jineta1.,1989;Lueta1.,1991;金立培 等,2000),说明小核对形态发生或者对维持正常 的生活和生存能力等方面起着重要作用.然而,小 核在有性生殖过程中参与形态发生的证据则主要来 自几种草履虫的研究(Ng,1986;Tamet?, 1986;Chauetal,1988).在腹毛类纤毛虫有性 生殖过程中,小核形态发生作用的有关报道尚不多 见.对尖毛虫(Diller,1965)和棘尾虫(史新柏 等.1990;Luetal,1991)无小核体的有性过程 观察表明,其接台后体不能形成完整的口器,不能 摄食而死亡.关于冠突伪尾柱虫(Pseudot2TO5tyln crlstata)无小核体之间接台生殖的研究,至今未 见有关报道.为了深人了解小核在有性过程中的形 态发生作用及其影响程度和范围,探索不同腹毛类 纤毛虫小核体功能的异同,我们以冠突伪尾柱虫为 材料,对无小核体之间的有性接台进行专门研究. 1材料和方法 1.1细胞系和交配型 用于本研究的冠突伪尾柱虫2号和4号是两个 自然采集所建立的细胞系,在实验室已培养了近 10年;28和46号是不同交配组合接台后体的克隆 后代,为两个年轻的细胞系.2,4,28和46号分 属4个不同的交配型,其中任何两个细胞系之间均 能诱导正常的接合生殖,接台后体的成活率都在 90%以上. 1.2无小核细胞系的建立 当冠突伪尾柱虫细胞进行二分裂时,用显微手 术切除排列于融台大核左侧的数枚小核(Jinet n.,1989),分别用2,4,28和46号依次建立了 2am1和2am2,4aml,28aml和46aml等多个不 同交配型的无小核细胞系.与此同时,以正常细胞 系及有小核细胞切块再生所建立的细胞系如分别依 次来自2,4,28和46号的2ml,4ml,28ml和 46ml等进行对照实验. 1.3细胞培养,接合诱导及细胞学观察 细胞培养,接台诱导及以蛋白银染色为主的细 胞学观察等方法与以前的报道相同(金立培, 1995;金立培等,1997).冠突伪尾柱虫的接台生 殖严格限于两个互补的交配型之间进行.当细胞进 人指数生长期时,取两种相应交配型的无小核细胞 (amicronucleate,Am)等量混合(Am×jam)于新 鲜Pringsheim培养液内,置27*(7诱导交配反应, 同时以两种相应交配型的有小核细胞 (micronucleate,Mi)等量混合(Mi×Mi)作对照. 具体交配组合详见表1.为了测定接台率,用4cm 塑料皿分装5ml新鲜培养液井用微吸管移人两种 相应交配型细胞各25只,记录每交配皿内24h形 成接台对的数量. 2000-12—28收稿,20010208修回 *国家自然科学基金(No39970089)贷助项目 第一作者前介金立培,男,56岁,硕士.教授.研究方向:动物细胞,遗传与发育.E-~i[:{@21… 3期金立培等:冠突伪尾柱虫接合过程]lx核的形态发生作用 2结果 2.1无小核细胞交配反应能力下降 无小核细胞之间各交配组合及对照24h内接 合对形成率列于表1. 衰1冠突伪尾柱虫AmxAm殛对照Mi×Mi各组台 24h内接台对形成率 Table1Thefrequencyofpair-formationinconjugation amongamicronucleatescAm×Am)andamong micronucleates(MixMi)inP.cri~fatain24h A:投有交配反应的培养未列入坑计数据之由.其中包括2m1× 4珊1的5皿;2era2×28m1的2皿;2m1×46m1的6皿; 28m1x46aml的5皿;28×46的1皿;4×46的1皿;B每十变 配培养由两种相应交配型各25个细胞混台而成,24h内由于某些 细胞分裂后再接旨.放有些培养皿内的接音对鼓多于25:C:Am 为无小棱细胞.Mi为有小核细胞(A:Excludedfromthestatlstics arethosecultuI~esinwhichno~jngationoccurred.Theseintruded5 cu[tur~of2m1×4mt.2cu[t~esof2?也×28珊1.6cult…of 2m1×46m1.5culturesof28m1×46am1.1cultureof28×46and 1eu[tu~of4×46:B:Eachmatingcultureinitiatedwith25ceilsof 瞄chumtingtypeInaJewcase5Morethall25pairswcrcobservedin24 hrsowingto…ofthecellshavingdividedpriortoconjugation:C: Am柚dMiaabbre?ationofthe…【粕sandthe 131icronucl~tesre~pectivety) 从表1可见,Am×Am接台对的形成率明显 低于对照Mi×Mi各组合,说明细胞失去小核后, 其交配反应能力显着下降. 2.2AmxAm接合体的发育 在无小核细胞有性接台过程中,接台双方没有 新的核器发生,但老太核照常逐步解体(图版I: 1).为了评估小核在接合生殖过程中对皮膜形态发 生的影响,我们对Am×Am和对照Mi×Mi进行 了比较观察结果表明,无小核体接合双方均可通 过第一次皮膜形态发生,但不能启动第二次皮膜改 组,全部接合后体在拟包囊早期夭折. Am×Am接合体纤毛器原基的发育按一定的 时空顺序进行,即口围带原基(primordiumof adoralzoneofmembranelles,AZMP),额,腹,横 棘毛列原基(primordiumoffrontal—ventra1. transversecirri,FVTP),左,右缘棘毛列原基 (primordiaofleftandrightmarginalcirrirOWS.I& RMCP),波动膜原基(primordiumofundulating membrane,UMP)和背触毛列原基(primordiaof dotalbristlerows,DBPs)按先后次序相继出现和 分化,而波动膜原基在分化之前便退化了(图版 I:2,6).与正常接合体相比,最明显的区别是 接合体内没有新的核器发生,另一个明显的区别 是,口围带原基比正常接合体短.根据同期口围带 原基区纵向长度的测量统计,无小核接合体口围带 原基的平均长度大约只有正常接合体的一半(表 2) 衰2冠突伪尾柱虫无小核体之间(AmxAmJ殛对照 有小核体之间(Mi×Mil各交配组台接台体 同期AZMP纵向长度(m)的比较 Table2ComparisonoftheAZMprimordiumcAZMP)in length【m】atthesamedevelopmentstageofthefirst corticalreorganizationjnc0njagantsfrommating combinationamongamicronucleates(AmxAmland amongmicronuclealescMixMi)inP.cristata 交配组音AZMP平均长度(m)标准差样奉教幅距 (bi?ab_m?鼬nofAZMp[engthSDS~mpLSsizeR删e 纤毛器原基区缩小进一步影响相应纤毛器的分 化发育,直接导致其组成部分减少,如El围带 (AZM)的小膜数,额腹横棘毛列(FvT)的棘毛 数等均比小核接台体明显下降(表3). 410动物学报48卷 衰3冠突伪尾柱虫无小核体之间IAmxAm}及对照有小核体之间CMixMi}各交配组合第一 次皮膜 改组后AZM的小膜数和Fvr的棘毛数比较 Table3Comparisonoftheciliaturesafterthefirstcorticalreorganizationinconjugationamongamicronu cleates 【AmxAmJandamongmicronucleatescMi×Mi)inP.cristata 第三个重要的区别是,无小核接合体纤毛器原 基的分化发育往往出现异常,导致接合后体纤毛图 式畸形(图版I:5,9)畸型主要表现在:额棘 毛(FC),腹棘毛(VC)排列不规则;额棘毛毛 基板的大小相差悬殊;腹棘毛列的某些区段仅有一 列棘毛,而不是通常的两列;某些缘棘毛的毛基板 由两小块构成不规则的形状,或因多个毛基板不能 分开而保持条状等.含有一种或数种畸型的接合后 体所占比例高达5O%以上,如2aml×4aml为 74.5%(35/47),28aml×46aml为53.5%(38/ 71). 2.3拟包囊的形成殛发育的中止 与正常情况一样,无小核接合后体照常能自由 泳动约24h,然后逐步停止运动,转变成近球形的 拟包囊(图版I:1O,12).但值得注意的是,有 近半数的无小核接台对,其接台双方自始至终紧密 地连在一起,直到拟包囊形成时也不分离.因接台 双方融合的部位和范围不同而产生一些橄榄形,哑 铃形等不规则的连体拟包囊.在Mi×Mi交配组台 中,虽然也存在接合双方不分离的现象,但连体拟 包囊出现的频率远比Am×Am组合低.通过4个 不同交配组合的活体计数,连体拟包囊所占的比例 是:2aml×4aml为47.7%(52/109),对照2×4 为3.3%(5/152);28am1×46aml为45.8% (38/83),对照28×46为5.1%(6/118). 另一方面,无小核接台后体在转变成拟包囊 时,其皮膜上的纤毛器并不消失或者太多数被保留 下来(图版l:10,12).口围带在拟包囊的皮膜 上有的保持完整,有的折成数段.其它纤毛器如额 腹横棘毛列及缘棘毛列等,有的基本上维持原来的 空间排列,有的则困拟包囊形成时发生收缩而使原 来的空问排列扭曲,变形.虽然Mi×Mi也有约 2/3的拟包囊残留1至数根棘毛或触毛的现象(金 立培,1995),但口围带及如此众多的纤毛器同时 被保留下来的现象则是很特别的.这一事实表明, Am×Am接台后体在转变成拟包囊时,在很大程 度上丧失了吸收老纤毛器的能力. 拟包囊形成后22,32h之问,细胞首先与培 养皿底部粘连,然后完全解体.此时离正常接合生 殖第二次皮膜改组的启动尚有1,2d时间. 3讨论 3.1小核对早期有性过程具有多方面的影响 冠突伪尾柱虫互补交配型无小核细胞之间能够 进行有性接合,但交配反应能力比有小核细胞低, 接合对形成率明显下降;接台体能完成第一次皮膜 形态改组,但因没有新的核器发生,不能启动第二 次皮膜改组而中止发育;第一次形态发生事件在时 空程序上与正常接合体并无明显差异(金立培, 1995),但口围带原基较短小,所分化的小膜数以 及额腹横棘毛列原基所分化的棘毛数均明显低于正 常接合体,而且纤毛器原基分化往往出现异常.此 外,接合配偶分离成两个接台后体的能力下降,接 台后体转变成拟包囊时失去吸收原有纤毛器的能力 等亦是很鲜明的特征.由此可见,小核的丧失对于 冠突伪尾柱虫通过第一次皮膜改组虽然不构成严重 障碍,但由于多种能力衰退或丧失并出现发育畸 形,反映出小核对于维持有性生殖早期及第一次皮 膜形态发生的正常进行仍具有某些明显的体功能 类似的现象亦见之于棘尾虫(史新柏等,1990; 3期金立培等:冠突伪尾柱虫接台过程中小核的形态发生作用4l1 Luetn.,1991),尖毛虫(Diller,1965)等腹毛 类纤毛虫无小核细胞的有性过程,虽然其表现形式 不尽相同 3.2有性生殖过程中第一次形态发生的实质是无 性发育 无小核接合体能够通过第一次皮膜改组但存在 某些缺陷,说明这一形态发生事件主要有赖于大核 的功能,小核在此过程中仅发挥某些次要的作用. 有趣的是,这些现象与该虫失去小核后无性分裂的 情形很相似(Jin”a1.,1989),其皮膜形态发生 照常能进行,但纤毛器的结构会出现某些缺陷. Ng(1990)根据有关研究提出,腹毛类纤毛虫有 性生殖时皮膜形态发生存在有性周期和进行着的无 性周期的重叠.他认为,第一次皮膜改组相当于无 性分裂后仔虫的早期形态发生,主要依赖于大核 (营养核),而小核(生殖核)仅起一种辅助作用, 故第一次改组的实质是无性发育.我们的上述观察 结果从一个侧面为此假设提供了印证. 3.3大核原基的基因组重排是启动第二次形态发 生的关键 Ng(1990)还认为,第二次皮膜改组是有性 生殖所特有的,它的启动是进行有性发育的关键, 这有赖于合子后的大核原基在染色体多线化至 DNA贫乏期所提供的决定性信号.因此,第二次 皮膜改组代表真正的有性发育,相当于多细胞生物 的胚胎发育.无小核冠突伪尾柱虫接合后体的夭折 可以得到同样的理解,它们没有大核原基及其所进 行的基因组重排,无法为启动第二次皮膜改组提供 决定性指令,终止发育是预料中之事.如果这一解 释正确的话,只要大核原基的发育能跨越DNA贫 乏期,就能顺利完成整个有性发育过程.事实上, 我们利用有小核体与无小核体进行交配(金立培 等,2001),虽然大核原基由半合子(配子核)演 变而来,但足以挽回部分有性后代覆灭的命运. 参考文献【References) Chau.MFandS.FNg1988Thesomaticfunctionofthemicmnucleusin~xua]repmduction0fPammeciuf …reli?i0Jtiation0f0ral membrane1]ea~emblyJ.Ceil&E89;157—166 Dill~.WF1965Therela6on?leicostoatugenicactivityduringconjugationin~eralciliatesJMorphology116:51,”. Jin,LP1995Fourroundsofcorticalde~eloprnentdurmgsexuW口[0dun?ninPseudou~st2da?ActaSvienNaturUniSunY S34(2):68--78[金立堵1995冠突伪尾柱虫有性周期中的四撬皮膜改组中山大学学报(自然科学版)34(2):68--78 Jl?,LPandS.FNg1989Thesomaticfuncti~thegemlnudeusinP 洲”rtycristata:asexualreproductionandstomatugenesisJ Pmtoz~ol36:315,326 Jin,LPemdFKGu1997s【啪togene…d.fadorn(fmemhranellesduringphysidngicalrg曲?时川nP粥e加出 crlstataActa面0.Sin43(4):420--435:金立培,顾福康1997冠突伪尾柱虫生理改组中口器发生及口匿带调节重建的研究. 动物学报43(4):420,425】 jm,LP.aedXYnu2000s曲onthe~maticfuaeu~nthe…uckusinP州0sl腓Ac船SrienNntrU…iS口Y S.39(5):120,122.[金立培,刘小意20[H]魏氏拟尾柱虫小棱体功能的研究中山太学学报(自然科学版】39(5):120,122] Jin,L.P.xYu曲dHZJin2001Nuctearcomrolofcortic*dd~etopmentduringconjugationinP~udourostylacristataZoolR es22 (2):99-1O4【金立培.刘小意.金华中2001冠突伪尾柱虫有性生殖期间皮膜发育的核控制.动 物学研究22(2):99,104] Lu-L?XBShia力 dSFNg1991Nucte~rcontrolofmrticatr~rganizationduringsexuMrepmductionofStylonychiamy~ilusastudywith ?nudt.EuropJ.P~tistol26:330,339 Lu,LandSFNg?1991Somaticfunctionofthemicmnudeusin~tylonychiamMilusduringasexualpropsgatranE”top』Pmtistol27: 26,39 Ng?SF.1986The~maticfuoctionofthemicmnuc[eusofdlhtedprotc~oaProgresxinP~tistology1:215--286 Ng?SF1990OevelopnaentMheterochronyincil/atedprotozoa:overlapof~exua[andsex~tcyclesdurmgconjugationBiofRev65:19一 】0】 1990Thenuclear~ffectonrnorphugenesisduringconjugationinStylon3~hiam~tilus.Actaz? 卢莉,榇振康1990棘尾虫接台生殖期问校对形态发生的影响.动物学报36<1):1, TakahashJ,T1988Reorganizationinamicronuclmtmwithdef~tivemouthofthecitiatep~eudo”msts4a Levii』P35:142,150 Tam?LW-a力dS-FNg1986Theroteofthemlct’on~leusinstonmtngenesizinsexua]reproduction.f? mmH耐证:】aser m…bemirradiationofthenlicronucl~sJCell&86:287,303 建 K 秆 Z( 引 412动物学报48卷 外文摘要(Abstract1 MORPHOGENETICROLEOFTHEMICRONUCLEUSDURING CONJUGAT10NINTHEHYPOTRICHOUSCILIATE (PSEUDOUROSTYLACRISTATA) 儿NLi—PeiLIUXiao—YiJINHua—Zhong (SchoolofLi/eSciences.zJl0gnUni~rsity,G眦b”510275,Chinaj SexualreproductionofthehypotrichousciliatePseudourostylacristatatakesplaceonlybetween complementarymatingtypes.Toassesstheparticipationofthemiemnueleusincorticaldevelopmentduring sexualreproduction,severalamieronucleatecelllinesweregeneratedbyamputationofceilsfromfourstocks whichbelongedinfourdifferentbutcomplementarymatingtypesbetweenanytwoofthem.These amicronucleatecelllineswere2am1and2am2fromstock2,4amlfromstock4,28amlfromstock28and 46amlfromstock46respectivelyTheconjugationofamieronueleatesbetweentwomatingtypeswaSinduced andresearched.Inthemeantime,theconjugationbetweenmieronucleates,whichincludedstock2,4,28,46 andmielonucleatecelllines2mlfromstock2,4mlfromstock4and28mlfromstock28derivedalsoby amputationofcells.wasusedascontro1.rnfollowthecourseofdevelopmentofthecortexandthenucleiwasby protargolstaining. Duringnormalconjugation,micmnueleateceilsreorganizedtheircorticalstructureforfourmunds,each timeresorbingthepre—existingciliatureandproducinganewset.Incontrast,duringconjugationamong amicronucleates,theceilsdevelopedfrompairingtoformationofsphericalparaeystsinamannersimilartothat situationamongmicronucleatesbutdiscontinuedtheirdevelopmentbeforeinitiationofthesecondcortical reorganization.Theycouldcompletethefirstconicalreorganizationlikemieronueleateceilsdid.Attheendof thereorganization.theexconjugan~againdidnotpossessundulatingmemhrane(UM);onlyhalfoftheceils possessedtheoralcirrus:thecytopharynxwaSunderdeveloped;therewereonly6rowsofdorsalbristles,aS usua1.However.therewere8omeevidentdifference~comparedwithmieronucleates.First,itwasclearthatthe conjugatingpairsformedfewerthanamongmieronueleates.Second,differentiationandpositioningofthe ciliatureprimordiainamicronucleatesbecameabnormal,suchas:somebarsoftheprimordiumofmarginalcirri lowswerenotdividedintothesinglecirri;thefrontalcirridifferedfromeachotherinsizeandarranged disorderlyandunsystematieally;therewasonlyonerowoftheventralcirriinsomesection;theprimordiaof adorallonemembranelles(AZMP)inlengthatthesamedevelopmentstageofthefirstreorganizationwere shorter;thenumberofAZMmembranellesandfrontal—ventral—transversecirri(FVT)afterthereoga nization waSmorereducedthaninthenormal;andfinally,theexconjugants.withoutlosingalloralmostalleiliature afterthefirstreorganization,transformedintotheparacystsandperishedinevitablybeforeinitiationofthe secondreorganizationOntheotherhand,itwasclearthattherewerenonewnucleogenesisinthe amlcronucleateconjugantsandrearrangementofthegenomieDNAsequencesofmaclonueleardevelopmentinthe excougants. Theresultssuggestthatalthoughthemie/-onucleusisnotabsolutelyrequiredforthefirstreorganizationas This—kw?supportedbythegrantfr?NSFC(No39970089) **CorrmpondingauthorEmail:lpjin@21enCON1 3期金立培等:冠突伪尾柱虫接台过程中小核的形态发生作用413 inasexualcycle,yetitstillmaintainssomesomaticfunctionsintheprocessOntheotherhand,theseresults showthatinitiationofthesecondcorticalreorganizationdependsonsignalsfromthemacronuclearanlageafter chromosomalpolytenizationandgenomicrearrangenlent.Thedevelopmentalsignalsrequiredforinitiatingthe firstandthesecondroundsofreorganizationarethereforedifferent.Theaboveconsiderationssuggestthatthe characterofthefirstreorganizationisasexualandthesecondoneisthe’true’corticalreorganizationuniqueto sexualreproduction. KeywordsHypotriehousciEate(Pseudouros~encristata),Micronucleus,Sexualreproductlon. Morphogenesis 图版说明(ExplanationofPlates) 图版I(PlateI) lAm)Am接台对,细胞内除大棱外没有新棱器发生的迹象(AconjugatingpairfromAm×Am.i? hih【heId…1Ei.bu… nucle~genesisexists)×600 2--4Ant~Am接合体,箭号指AZM原基的发育 [CorJjugantsfmmAm×Am,ShowingdeveloplitfAZMprimordla(…s)]×800 5AmxAm接台伴,示额棘毛(Fc)厦左缘棘毛列(箭号)分化异常 [Conjug~tsfromAm×Am,sbowingab力?Idiffer朗tiationoffrmltal cirri(FC)andleft…0mhalcirri{a仃ows)]×800 6同上(Sameabove) 7--9Ant×Am接音后体,示额棘毛(Fc)大小不一,排列紊乱,腹棘毛(vc)仅l列,以丑缘棘毛列某 些毛基板不分开或呈条状(箭 号j【ExconjugantsfromAm×Am,showingabno~ldiffemntlationofFCinsizear,d~rangenlentonly, o?tralirri(VC).and thatsomegroupsofbasaIbodi~intheleftrdwsofnmrffinalcirribecomestripedanddon.cpart(mws)]×800 10--12Am×Am拟包囊.纤毛器多不消失,箭号指残留的AZM小膜 [ParReystsfromAm×Am,sbowingthatAZMmembr—Hesf…】 andrtcorticei~atureareleftover3×800