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细菌基因组DNA提取实验.doc

细菌基因组DNA提取实验

石钟省
2017-09-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细菌基因组DNA提取实验doc》,可适用于综合领域

细菌基因组DNA提取实验标签:细菌基因组DNA提取细菌基因组DNA提取可以:()获得细菌基因组DNA()作为PCR模板()用于测序、遗传信息分析等。实验方法,细菌基因组DNA试剂盒提取法本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术结合DNA制备膜选择性地吸附实验方法原DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合于从×细菌中获得多至理μg的基因组DNA。用于PCR、Southern印迹分析、RAPD、RFLD等分子生物学实验。实验材料细菌培养物试剂、试剂细菌基因组DNA试剂盒盒仪器、耗材DNA制备管小量滤器离心管一、试剂盒组成、贮存、稳定性说明书耗材:DNA制备管小量滤器ml离心管ml离心管。RNaseA:mgml室温保存。溶菌酶:甘油溶解溶菌酶使溶菌酶浓度为mgml密闭贮存。BufferS:细菌原生质制备液加入RNaseA后密闭贮存。MEDTA:室温密闭贮存。BufferGA:裂解液室温密闭贮存。实验步骤BufferGB:蛋白去除液室温密闭贮存。BufferDVA:BufferDV的制备液请参照实验准备BufferDV的配制方法配制室温密闭贮存。BufferDV:相分离液室温密闭贮存。BufferBV:DNA结合液室温密闭贮存。BufferW:洗涤液室温密闭贮存。BufferWconcentrate:去盐液。使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀室温密闭贮存。可用乙醇或乙醇。Eluent:mMTrisHClpH室温密闭贮存。二、实验准备第一次使用时在BufferW中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。准备BufferDV:取mlBufferDVAml异丙醇ml异丁醇加入提供的ml试剂瓶中混合均匀。预冷BufferDV。第一次使用试剂盒时用甘油溶解溶菌酶使溶菌酶浓度为mgml。第一次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNaseA全部加入BufferS中混合均匀。准备水浴。检查BufferGA和BufferGB是否出现沉淀若出现沉淀于水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。将Eluent或去离子水加热至有利于基因组DNA的充分洗脱。三、操作步骤用ml离心管收集×(ml菌液OD为)的细菌培养物×g离心s弃尽上清。用μl已加入RNaseA的BufferS悬浮沉淀。*确认RNaseA已加入BufferS中。*悬浮需均匀不应留有小的菌块否则将影响溶菌效果。加入μl溶菌酶贮存液混合均匀室温静置min。加入μlMEDTA(pH)混合均匀冰浴min。加入μlBufferGA,旋涡振荡s水浴min。加入μlBufferGB和mlBufferDV(预冷)用力混合×g离心min。*请在实验前按照实验准备步骤内容准备BufferDV。尽可能丢弃上相保留相间沉淀和下相。加入ml预冷BufferDV用力混合×g离心min。丢弃上相将下相转移至滤器(滤器置于ml离心管中)。×g离心min。*上相无需完全弃尽在转移无色下相时偶有混入的上相可在Tip头内迅速分相便于丢弃。*如在转移过程中吸入少量界面沉淀不必去除可过滤除去。*有色上相务必除尽否则将抑制DNA结合到silica膜上。弃滤器在滤液中加入μlBufferBV混合均匀。步骤可选择离心法或负压法A负压法A将制备管插到负压装置的插口上将步骤中的混合液移入制备管中开启并调节负压至英寸汞柱吸尽管中溶液。A保持负压加入μlBufferW吸尽管中溶液。A保持负压沿管壁四周加入μlBufferW吸尽管中溶液以同样的方法再用μlBufferW洗涤一次。*确认在BufferWconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。*沿管壁四周加入BufferW有助于彻底冲洗沾附在管壁上的盐份。*两次用BufferW冲洗能确保盐份被完全清除消除对酶切反应的影响。A将制备管置于一个ml离心管中×g离心min。B离心法B将制备管置于ml离心管中将步骤中的混合液移入制备管中,×g离心min。B弃滤液将制备管置回到原ml离心管中加入μlBufferW×g离心min。B弃滤液将制备管置回到原ml离心管中加入μlBufferW×g离心min。以同样的方法再用μlBufferW洗涤一次。*确认在BufferWconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。*两次用BufferW冲洗能确保盐份被完全清除消除对酶切反应的影响。B(弃滤液将制备管置回到原ml离心管中×g离心min。将制备管置于另一洁净的ml离心管中在silica膜中央加μlEluent或去离子水室温静置min。×g离心min洗脱DNA。*将去离子水或Eluent加热至将提高洗脱效率。收起BufferGB、BufferBV和BufferW含刺激性化合物操作时要戴乳胶手套和眼镜避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时注意事项要立即用大量水或生理盐水冲洗必要时寻求医疗咨询。

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