应用SELDI-TOF MS质谱技术构建临床常见病原菌蛋白指纹数据库（可编辑）

应用SELDI-TOF MS质谱技术构建临床常见病原菌蛋白指纹数据库（可编辑） 中图分 类号:R372 硕 士 学 位 论 文 应用 SELDI-TOF MS 质 谱 技 术 构建临床常见病原菌蛋白指纹数据库 院 (系 ) 、所 临 床 医 学 院研 究 生 姓 名 张 航 烽学科、 专 业 内 科 学导 师 姓 名 黄文芳教 授 二 Ο一 三年 四月 目 录 英汉缩略 语名词 对 照. 1 中文摘要3 英文摘要6 前 言. 10 第一部分 建 立细菌 蛋白指纹 数据库 基 础 13 1.1 实验 材料 13 1.2 实验 方法 16 1.3 结果. 20 1.4 讨论. 37 第二部分 9 种细菌 蛋白指纹 数据库 的 构建及评 价. 41 2.1 实验 材料 41 2.2 实验 方法 42 2.3 结果. 43 2.4 讨论. 55 全文 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf . 57 参考文献. 58 综 述. 62 参考文献. 68 致 谢. 72 攻读硕士 期间发 表 的学术论 文. 73 泸州医学院硕士研究生 学位论文 英 汉缩略 语名词对 照 英文缩 写 英文全称 中文全称 aba Acinetobacter baumannii 鲍曼不动 杆菌 ACN Acetonitrile 乙腈 ATCC American type culture collection 美国 模式培养物集 存库 bp Base pair 碱基对 ? Centigrade 摄氏度 CO Carbon dioxide 二氧化碳 2 Da Dalton道尔顿 ecl Enterobacter cloacae 阴沟肠杆 菌 eco Escherichia coli 大肠埃希 菌 efa Enterococcus faecalis 粪肠球菌 efm Enterococcus faecium 屎肠球菌 h hour 小时 kpn Klebsiella pneumoiae 肺炎克雷 伯菌 L Liter 升 MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/ 基质辅助激光 解 MS Ionization Time of Flight Mass 吸电离飞行时间 Spectrometry 质谱 min Minute 分钟 1 泸州医学院硕士研究生学位论文 mol Mole 摩尔 MW Molecular weight 分子量 pH Potential of hydrogen酸碱度 pae Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单 胞菌 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链 式反应 rpm round per minute 转/ 分 rRNA Ribosomal RNA 核糖体 RNA s second秒钟 sau Staphylococcus aureus 金黄色葡 萄球菌 sep Staphylococcus epidermidis 表皮葡萄 球菌 SELDI-TOF Surface-enhanced laser desorption 表面增强激光解 MS & ionization time of flight mass 析离子飞行时间 spectrometry 质谱 SPA Sinapic acid 芥子酸 μl Microliter 微升2 泸州医学院硕士研究生学位论文 应用 SELDI-TOF MS 质 谱 技术 构建 临床常 见病原菌 蛋 白指纹 数据库 摘 要 目的: 分 析临床 常 见病原菌 SELDI-TOF MS 蛋白指纹图 谱,筛选 稳 定表达蛋 白标志 物 , 建立 9 种细 菌蛋 白指纹数 据库 , 运 用临床菌 株对 数据库的 鉴定能 力 进行验证 ,为细 菌 感染的快 速诊断 奠 定基础。 方法:1. 收 集 四 川 省 人 民 医 院2012 年5 月至2012 年9 月 临 床 分 离 经 全 自动微生 物分析 仪 鉴定的菌 株 。2. 扩增16S rRNA 基因 对 细菌进行 分 子 生 物学 鉴定 。3. 通过 不同 点样 孔 和不 同Au 芯 片 上 多次重 复 检测 同 一株细菌 蛋白 , 分 析其蛋白 指纹图 谱 差异, 评价质 谱仪 和芯片检 测细 菌蛋白的 重复性 。4. 比较3 株 参考菌 株 在不同培 养基中 蛋 白指纹图 谱 差 异 , 分 析 不 同 培 养 基 对 细 菌 蛋 白 指 纹 图 谱 的 影 响 。5. 比 较 细 菌 蛋 白指纹图 谱在不 同 培养时间 下的差 异, 分析培养 时间对 细 菌蛋白图 谱 的 影 响 。6. 比 较 同 种 细 菌 不 同 株 之 间 蛋 白 指 纹 图 谱 差 异 , 验 证 同 种 细 菌 蛋 白 表 达 的 稳 定 性 。7. 比 较 不 同 种 细 菌 蛋 白 指 纹 图 谱 差 异 , 分 析其差异。8. 将收 集的菌株 分为建 模 组和验证 组 : 临床 分离细菌147 株与7 株参考 菌株设 为建模组 , 其 余378 株临床分 离菌株 为 验证组 。 分 别 检测 其蛋 白表达, 分析 蛋白 指纹图谱 ; 筛 选出 建模组中9 种细 菌各 自稳定表 达的蛋 白 峰, 将数 据导入 自 建的Fingerwave 软 件 , 构建细 菌 蛋 白 指 纹 数 据 库 。 9. 将 378 株验证 组 细 菌 的 蛋 白 峰 数 据 导 入 Fingerwave 软件与 蛋 白指纹数 据库进 行 相似度比 较, 对 蛋 白指纹库 的 3 泸州医学院硕士研究生学位论文 鉴定能力 进行验 证 。 结 果 :1. 收 集 临 床9 种细菌525 株 , 包 括 表 皮 葡 萄 球 菌38 株 , 鲍 曼 不 动 杆菌54 株 ,大 肠杆 菌123 株 ,肺炎 克雷 伯菌99 株 ,粪 肠球 菌22 株, 金黄色葡 萄球菌50 株, 铜 绿假单 胞菌83 株 , 屎肠 球菌22 株 和阴沟肠 杆 菌34株。2. 实 验菌株16S rRNA 测序 结果 与GenBank 中该菌 株基 因 序 列一致性均?98% ,鉴定为相应的细菌 。3. 分析同株细菌 蛋白指纹图 谱,其主要蛋白峰在孔间和芯片间分子量变异系数均?0.05% 。4. 比 较不同培 养基上 生 长的同株 菌蛋白 指 纹图谱, 显 示在不 同 培养媒介 其 细菌特征 蛋白恒 定 表达。5. 不同 培养 时间对细 菌蛋白 表 达影响很 小, 其蛋白指 纹图谱 共 有蛋白峰 分子量 变 异系数均?0.2% 。 6. 同种细菌 不 同株之间蛋白指纹 图谱共有蛋白峰分 子量变异系数均?0.5% ,细菌蛋 白表达稳 定。7. 在分子量3 000-20 000Da 范围内, 临床常 见9 种 细菌 有各自特 异的蛋 白 指纹图谱 。8. 筛选 出9 种 细菌蛋 白指纹 图谱各自 稳 定 表达 的蛋 白峰,初 步建 立临 床常见9 种 病原 菌的 蛋白指纹 数据 库。 9. 将 验 证 组 菌 株 蛋 白 指 纹 数 据 与 建 立 的 蛋 白 指 纹 数 据 库 进 行 比 对 , 鉴定结果 的符合 率 分别为 表 皮葡萄 球 菌95.0% (19/20 ) 、 鲍曼不动 杆 菌85.3% (29/34)、 大 肠埃希菌96.2% (101/105 ) 、 粪肠 球菌100% (11/11)、 肺炎克雷 伯菌88.8% (71/80 ) 、 铜绿假 单胞菌90.5% (57/63 ) 、 金黄 色葡萄球菌97.5% (39/40 )、屎肠球菌81.8% (9/11 ) 和 阴 沟 肠 杆 菌 85.7% (12/14 )。 结论:利用SELDI-TOF MS 技术检测 细菌蛋白 结合自 建Fingerwave 软 件 建立 的蛋 白指纹数 据库 进行 蛋白指纹 数据 相似 度比 较, 可同 时对9 4 泸州医学院硕士研究生学位论文 种常见临 床 病原 菌 进 行 鉴 定, 为 临床病 原 菌 的快 速 诊断提 供 了 可能 。 关 键词 : 细菌;表面 增强 激光 解析电离 飞行 时间 质谱; 蛋 白指 纹数 据库;鉴 定 5 泸州医学院硕士研究生学位论文 Application of SELDI-TOF MS mass spectrometry to establish a protein fingerprint database of common clinical pathogens ABSTRACT Objective: To Analyze the protein fingerprints of clinical common pathogens detected by surface-enhanced laser desorption & ionization time of flight mass spectrometry SELDI-TOF-MS, and to establish a protein fingerprint database of nine common bacteria by screening specific protein peaks, followed by evaluating its diagnostic value with clinical strains, which may lay a foundation for rapid identification of bacteriaMethods: 1. Nine species of clinical bacterial isolates of the Sichuan Provincial People's Hospital which identificated by Automated Microbiology Analyzer were collected from May 2012 to September 2012. 2. All species of bacteria were identified by 16S rRNA gene amplification and DNA sequencing. 3. The proteins of same strain were detected repeatedly with different spots and chips to evaluate its reproducibility. 4. The protein fingerprints of three reference strains derived from different culture media were analyzed to explore the effects of the culture media on the spectra. 5. The effects of different culture time on bacterial spectra were estimated by comparasion of the bacterial protein fingerprints after culturing for 24h, 48h and 72h. 6. The difference 6 泸州医学院硕士研究生学位论文 of protein fingerprints of different strains of same species was compared to demonstrate its reproducibility. 7. All isolates were divided into modeling set and testing set, 147 clinical strains and 7 reference strains were assigned into modeling set, and the rest 378 clinical strains were included in testing set. The protein profiles of all isolates were detected by SELDI-TOF MS. 8. The peaks of protein expressed stably in each species from modeling set were selected, and mean MW of each peak was calculated. Then the data were imported into self-created Fingerwave software to construct a protein fingerprint database. 9. The similarity of data between the protein fingerprints of 378 testing strains and the constructed database was analyzed to evaluate the concordance with routine identification methodsResults: 1. 525 clinical isolates of common bacteria specimens, including 38 Staphylococcus epidermidis, 54 Acinetobacter baumannii, 123 Escherichia coli, 99 Klebsiella pneumoiae, 22 Enterococcus faecalis, 50 Staphylococcus aureus, 83 Pseudomonas aeruginosa, 22 Enterococcus faecium and 34 Enterobacter cloacae were collected. 2. DNA sequencing results showed that the sequence of 16S rRNA gene of the experimental strains matched perfectly with that in GenBankmatching rate ? 98%. 3The protein profiling of the same bacterium had rigorous reproducibility and the CV of main protein biomarkers in molecular weight was less than 0.05%. 4. By comparing the protein fingerprints of the same strain 7 泸州医学院硕士研究生学位论文 cultured from different media, the results showed that protein peaks expressed stably presented in strains in spite of different culture media. 5Incubation time has little effect on bacterial protein fingerprints, and coefficients of variation of total protein peak molecular weight were less than 0.2%. 6. Similar protein fingerprints presented among the different strains of the same species and the CV of main protein biomarkers in molecular weight was less than 0.5%. 7. Nine species of bacteria had its characteristic protein fingerprints in the range of molecular weight from 3KD to 20KD. 8. In this preliminary research, initially a small scale of protein fingerprint database was established for nine common bacteria. 9By compared protein fingerprints data in testing set with that in constructed database, the results showed that the identification rate was 95.0%19/20 for Staphylococcus epidermidis, 85.3%29/34 for Acinetobacter baumannii, 96.2% ( 101/105 ) for Escherichia coli, 100%11/11 for Enterococcus faecalis, 88.8% (71/80 ) for Klebsiella pneumoiae, 90.5%57/63 for Pseudomonas aeruginosa, 97.5%39/40 for Staphylococcus aureus, 81.8%9/11 for Enterococcus faecium and 85.7%12/14 for Enterobacter cloacae, respectivelyConclusion: Common bacteria can be rapidly identified through established protein fingerprints database by application of SELDI-TOF MS coupled with self-created Fingerwave software, which provides a powerful tool for bacterial identification8 泸州医学院硕 士研究生学位论文 Key words: Bacterium, SELDI-TOF MS, Protein fingerprint database, identification; 9 泸州医学院硕士研究生学位论文 前 言 感染性疾 病是临 床 最常见的 疾病之 一 , 感染 的发生 、 发 展 与病原 菌、 宿 主的免 疫功 能状态及 抗生素 三 者有关 , 细菌 是感 染的首要 致病 因素, 可引起 人类 各种感染 性疾病 。 细菌在临 床分离 致 病菌中的 分布 以 革兰 氏阴 性菌为主 ,大 肠埃 希菌、铜 绿假 单胞 菌、鲍曼 不动 杆菌、 肺炎克雷 伯菌 、 阴 沟肠杆菌 占据临 床 感染前五 位; 而在 革兰阳性 菌中 分离率排 序依次 为 金黄色葡 萄球菌 、 凝固酶阴 性葡萄 球 菌 (表 皮葡萄 [1-2] 球 菌 为 主 ) 及 肠 球 菌 。 在 我 国 , 引 起 医 院 感 染 的 重 要 病 原 菌 中 上 [3] 述细菌也 位于临 床 感染病原 菌分布 前 十位 。 这 些临床 常 见病原菌 轻 者引起局 部感染 , 重者侵入 血流导 致 血行散播 而发生 菌 血症、 毒血症 或败血症 , 严 重威 胁人们的 健康和 生 命。 快 速准确 鉴定 引起感染 性疾 病的病原 菌种类 对 临床及时 准确诊 断 疾病、 抗菌 药物的 选 择及预后 评 价有重要 意义 。 快 速鉴定病 原菌对 患 者感染持 续时间 、 菌血症的 死亡 率 和院 内感 染的控制 都有 重要 作用,同 时能 减轻 病人的疾 苦和 负担。 其次, 若在感 染初期 就确诊感 染病原 菌, 可以减少 广谱抗 生 素的使用 , 有利于控 制临床 病 原菌对广 谱抗生 素 的耐药产 生。 因此 , 临床病原 菌 的快速鉴 定对抗 感 染治疗及 院内感 染 具有十分 重要的 意 义。 目 前临 床致 病菌 检测 和鉴 定方 法主 要是 依据 微生 物的 培养 特性 、 形态特征 、 生化 反 应、 血 清学鉴定 等 特性来实 现。 这 种 传统的细 菌鉴 定方法虽 然有较 高 的的敏感 性及专 一 性, 但是这 些方法 依 赖细菌生 产 代谢过程, 需要长 时间的孵 育, 一般 需要24~48h , 细 菌 生长时间 和分 10 泸州医学院硕士研究生学位论文 析周期较 长, 不能 满足临床 对感染 患 者的快速 诊断和 适 当的治疗 。 以 细菌核糖 体 (16S rRNA ) 基因序列分析 、 实时荧光 定量PCR 检测特 定 [4-7] 的 基 因 和 基 因 芯 片 技 术 为 代 表 的 分 子 生 物 学 方 法 被 认 为 是 传 统 微 生物鉴定 的替代 方 法, 但这 些技术 复 杂、 费时 、 耗 费高、 对操作环 境 和人员素 质要求 很 高 , 目 前不 适 用于临 床 微 生物 实 验室的 检 测 工 作。 基于基质 辅助激 光 解析电离 飞行时 间 质谱 (MALDI-TOF MS)技 术 的 微 生 物 蛋 白 组 学 是 近 年 来 迅 速 发 展 起 来 的 一 种 病 原 微 生 物 分 类 和鉴定的 重要方 法, 其基本原 理是利 用 质谱仪先 建立已 知 微生物的 标 准蛋白指 纹库, 将 未 知微生物 的蛋白 质 谱数据与 标准蛋 白 指纹库进 行 比 对, 从而 确定其种 类, 几分 钟就可鉴 定不 明细 菌、酵 母 菌和 真菌。 与传统的 微生物 鉴 定方法相 比, 具 有 操作简单 、 快速 、 准确性高 、 自 动化和高通量等优点。 已 有 的 研 究 主要 是 应 用MALDI-TOF MS 对单 克隆细菌 进行分 析 获得其指 纹图谱 , 然 后与商业 化的蛋 白 指纹数据 库 比对, 用匹配分 值 表示, 分值愈高 , 说明待测 菌株谱 图 同质谱库 中某 [8-9] 一 参考菌 株的谱图愈 相近 , 从而 对细菌 进行鉴 定 。 国外已 有多位 学 [10-13] [14] [15] 者 证 实利 用MALDI-TOF MS 对 临 床 分离 细 菌 、 真菌 及 病毒 进行鉴定 有较高 的 鉴定率。 近年来高 灵敏度、 高 通量的表 面增强 激 光解析离 子飞行 时 间质谱 Surface-enhanced laser desorption & ionization time of flight mass spectrometry ,SELDI-TOF MS 技 术是目 前蛋 白质 组学 研究 的突 破 性 [16-19] 新技术, 已广泛 运 用于各种 疾病特 异 性标志物 的筛选 , 血清中 小 分子物质 含量测 定 , 新药 的研制与 开 发, 蛋 白质相互 作 用等领域 。 该 11 泸州医学院硕士研究生学位论文 技术由2002 年诺 贝 尔化学奖 得主田 中 发明, 具有样 本用 量小, 敏感性 高(1fmol ) , 检 测蛋 白 质 分 子 量 范围大 (0-500kD ) , 检测 速 度 快 , 重复性好 等特点, 但 将其运用 于微生 物 分离和鉴 定方面 的 报 道 却很 少。 有国外学 者研究 利 用SELDI-TOF MS 检测细菌蛋 白表达, 建立起淋 球 [20] [21] [22] 菌 、 肺 炎 克 雷 伯 杆 菌 及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 快 速 诊 断 模 型 , 可 对 这些细 菌进行 快 速、 准 确鉴定 。 该技术 与现有 的微生 物 常规鉴定 方 法相比可 节省24-48h , 但利 用该诊 断模 型每次只 能鉴定 一 种细菌, 不 [30] 能适应临 床常规 鉴 定的需要。 闫慧等 利用SELDI-TOF MS 检测临床 常见革兰 阳性细 菌 蛋白, 并根据 相似 度分析软 件, 建立 了临床常 见革 兰阳性细 菌蛋白 指 纹库, 结果 显示通 过 相似度对 比能准 确 鉴定待检 细 菌。本研究基于MALDI-TOF MS 分 离 鉴 定 细 菌 的 思 想 , 拟 采 用 SELDI-TOF MS 技 术 检 测 细 菌 蛋 白 的 指 纹 图 谱 , 结 合 自 行 设 计 的 Fingerwave 软 件 建 立 临 床 常 见9 种 病 原 菌 蛋 白 指 纹 数 据 库 , 通过未知 菌蛋白指 纹与已 知 数据蛋白 指纹数 据 库的相似 度对比, 达 到快速鉴 定 细菌的目 的。 12 泸州医学院硕士研究生学位论文 第 一部分 建立细菌 蛋白指 纹数据库 基础 1.1 实验材料 1.1.1 菌株 收集临床分离经法国梅里埃公司全自动微生物分析仪VITEK-2 鉴定的菌株,所有临床菌株均源于四川省医学科学院? 四川省人民医 院2012 年5月至2012 年9 月 的门诊 和住院 病例, 标本类 型包 括痰液 、 伤 口分泌物 、 腹 水、 胸水、 脑脊液 、 尿 液及血液 等, 其中 表皮葡萄 球菌 38 株, 鲍曼 不动 杆菌54 株 ,大 肠埃希菌123 株, 肺炎克 雷伯 菌99 株, 粪肠球菌22 株, 金 黄色葡萄 球菌50 株 , 铜绿 假单胞菌83 株, 屎 肠球菌 22 株 和 阴 沟 肠 杆 菌34 株,共9 种525 株 细 菌 。 所 有 菌 株 保 存 于-80 ? 冰箱。其保种液为血培养需氧培养基BacT/ALERT FA 。 另 参 考 菌 株 金 黄色葡萄 球菌ATCC 29212 、 ATCC 12600 , 大 肠埃希 菌ATCC 25922 、 ATCC 35218 , 铜 绿 假 单 胞 菌ATCC 27853 , 肺 炎 克 雷 伯 菌ATCC 700603 , 粪肠 球菌ATCC 29212 和屎肠 球 菌ATCC 35667 购自 温州康泰 生物技术 公司。 1.1.2 主要试剂 BacT/ALERT FA 需氧培养基 法国BioMé rieux 公司 普通血平 板 郑州安图 绿科生 物 公司 麦康凯琼 脂平板 郑州安图 绿科生 物 公司 MH 琼脂平板 郑州安图 绿科生 物 公司 巧克力色 血琼脂 平 板 郑州安图 绿科生 物 公司 13 泸州医学院硕士研究生学位论文 加万古霉 素巧克 力 色血琼脂 平板 郑州安图 绿科生 物 公 司 营养琼脂 平板 郑州安图 绿科生 物 公司 16S rDNA 扩增 引物 上海英骏 生物工 程 有限公司 2×Taq PCR masterMix 北京天根 公司 100bp DNA Ladder 北京天根 公司 TM GoldView 北京赛百 盛基因 技 术有限公 司 芥子酸 美国Sigma 乙腈 美国Sigma 三氟乙酸 美国Sigma 胰岛素 美国Sigma 细胞色素C 美国Sigma 肌红蛋白 美国Sigma 1.1.3 主要仪器 VITEK-2 全自动微 生物分析 仪 法国BioMé rieux 公司 CO 培养箱 法国Heraeus 公司 2 医用超低 温冷冻 ?80 ?冰箱 青岛海尔 公司 离心机 美国Beckman 公司 PCR 扩增仪PTC-200 美国Bio-Rad 公司 电泳仪SAV-570 美国Savant 公司 凝胶成像 仪 美国Bio-Rad 公司 生物安全 柜 上海博迅 公司 AU 蛋白芯片 美国Ciphergen 公司 14 泸州医学院硕士研究生学位论文 蛋白指纹 图谱分 析 仪PBS ?/C 美国Ciphergen 公司 Proteinchip Software 美国Ciphergen 公司 1.1.4 主要试剂配制 1.1.4.1 能量 吸收分 子(SPA )的 配制 纯三氟乙 酸 (TFA ) 200μl , 加 蒸馏水 至20ml,与20ml 纯乙腈 (ACN ) 混匀, 用电 子天平 称取SPA 粉500mg , 震荡溶解 后分装 于Eppendorf 管 中,即 配 置成饱 和 的SPA 溶液,4 ? 保 存。 1.1.4.2 0.5mol/L EDTA 的配制 称取EDTA-Na ? 2H O (分子量372.24 )3.7224g , 加 入15ml 蒸馏水 2 2 中,NaOH 或浓盐 酸 调节pH 至8.0 , 不停 搅拌, 直至EDTA 能够完全溶 解,蒸馏 水定容 至20ml 备用。 1.1.4.3 0.5×TBE的配制 称取Tris base (分 子 量121.14 )54g , 硼 酸 (分 子量61.83 )27.5g , 20ml 0.5mol/L EDTA (配制方 法如上 所 述) , 加蒸 馏水至1000ml,混 匀后即5×TBE , 作 为储存液 , 琼脂糖 凝胶电泳 时用蒸 馏 水稀释10 倍使 用。 1.1.4.4 1% 的琼脂 糖 凝胶 的配 制 用电子天 平称取 琼 脂糖干粉0.3g , 倒入30ml 电泳缓冲 液 (0.5×TBE ) 中,震荡混匀,放入微波炉中高火加热1-2min ,至琼脂糖完全融解 , 在琼脂糖 溶液中 加 入1μl GoldView , 混 匀后倒入 制胶模 板 中, 待琼脂 糖凝胶冷 却凝固 后 即可用来 电泳。 15 泸州医学院硕士研究生学位论文 1.2 实验方法 1.2.1 菌株的收集和 保存 收集临床 分离的 常 见细菌以 先后顺 序 将其编号, 标本来 源 以痰液 、 伤 口 分 泌 物 和 血 液 为 主 。 取 血 培 养 需 氧 瓶 中 的 培 养 基1ml 于1.5ml 的 Eppendorf 管 中 , 刮取 一 接 种 环 的 细 菌 加 入Eppendorf 管 中, 混 匀 后将 Eppendorf 管盖 子盖 禁用封口 胶密封 , 冻存于-80 ?冰箱 保 存备用。 1.2.2 细菌培养 -80 ?冻存 的所有 试 验菌株室 温解冻 复 苏后, 将革 兰氏阳 性 菌 (金 黄色葡萄 球菌、 表 皮葡萄球 菌、 粪 肠 球菌和屎 肠球菌 ) 接种于血 平板; 革兰氏阴 性菌 ( 鲍 曼不动杆 菌、 大 肠 埃希菌、 肺炎克 雷 伯、 铜绿 假单 胞菌和阴 沟肠杆 菌 ) 接种于 麦康凯 琼 脂平板,35 ?、6.5% CO 条件下 2 培养18-24h , 然后 挑 取单个菌 落分别 接 种新的血 平板和 麦 康凯琼脂 平 板,35?、6.5% CO 培养18-24h 。收 集适量纯 菌至两个 装有1ml 灭菌 2 水的Eppendorf 管中 ,13000 rpm 离心3min ,灭菌 水洗涤 两 次,留取 细 菌沉淀备 用。两Eppendorf 管分别 用于分 子生物学 鉴定和 质 谱检测。 1.2.3 16S rRNA 基因测序鉴定 细菌 1.2.3.1 煮沸 法提取 细菌DNA 取300?l 灭菌 水与上 述细菌沉 淀Eppendorf 管中, 涡 旋混匀,100 ? 煮沸10min , 然后16000×g 离心3min , 取上 清液于另 一Eppendorf 管内, 上清液即 为细菌DNA 模板,-80 ?储存 备用。 1.2.3.2 16S rRNA 基因扩增通 用引物 [23] 采 用 丹 麦 国 立 参 考 实 验 室 微 生 物 鉴 定 应 用 的 引 物 序 列 ,扩增 16 泸州医学院硕士研究生学位论文 16S rRNA 基因中目 的片段526bp 。 引 物 由上海英 骏生物 工 程有限公 司 合成,序 列如下 : 上游引物 :BSF8 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' ; 下游引物 :BSR534 5'-ATTACCGCGGCTGCTGCTGGC-3' 。 1.2.3.3 PCR 扩增 16S rRNA 基因 扩增体系 (20μl 体 系): 体系成分 体积 2×Taq PCR masterMix10μl 引物F 1μl 1μl 引物R DNA 模板 2μl ddH O 6μl 2 总体积 20μl PCR 反应条 件: 94 ? 预变性5min , 94 ? 变性1min , 55 ?退 火1min , 72 ?延伸1min ,30 个循环周 期,72 ? 延伸5min 。 1.2.3.4 琼脂 糖凝胶 电泳检测PCR 产物 配制1% 的琼脂 糖凝胶 ,取5μl PCR 反 应产 物进 行电 泳,以100bp DNA Ladder 做参 照 ,100V 电 压运行 , 当指示剂 (溴酚 蓝 )移动到 距 凝胶边沿 约1.5cm 时, 停止电泳 , 后在 紫外灯下 观察, 用Bio-Rad 图象 分析仪扫 描。 1.2.3.5 序列测定及 分析比对 PCR 产物经 凝胶成 像分析, 若目 的片 段与预期 片段长 度 相符, 即 17 泸州医学院硕士研究生学位论文 将所有目 的基因 扩 增阳性的 PCR 产 物 送往上海 英骏生 物 工程有限 公 司测序; 测序结 果 与 GenBank 进行比 对分析, 从而鉴 定 细菌。 1.2.4 SELDI-TOF MS 的检测和 优化 1.2.4.1 分子量校准 将Sigma 蛋白标准品Insulin (MW5 733.49 , Cytochrome C (MW12 230 ,Myoglobin (MW16 950 )用蒸 馏水溶解 至终浓 度 为0.1μg/ml , 取 以 上 溶 液 各20μl 与 等 量 饱 和SPA 混 合 后 点 样 Au 蛋 白 芯 片 , 对 SELDI-TOF MS 质谱仪检测Au 蛋白芯 片 进行相对 分子质 量 校准。 1.2.4.2 仪器参数设 置 将激光强 度设置 为10 ; 检测 敏感度 设置 为8 ; 收 集位置20~80;平 均每 点收集次数20 ;信 噪比(S/N )分别为5 ,2 ;优化相对分 子质量 范围为2 000 -20 000 Da 。 1.2.4.3 细菌 蛋白检 测 取上述处 理好的 细 菌10μl 与饱 和SPA 等 量混匀,Au 芯片点 样, 每 孔点样3μl , 每个 标 本重复4 次, 室 温干 燥5min , 每孔 再加3μl 饱和SPA , 自然干燥 后上机 检 测。 1.2.4.4 SELDI-TOF MS 检测细菌样品的 灵敏度 将参考菌株金 黄色 葡萄球菌ATCC 29213 按 照步骤1.2.2 处 理,向 细 菌 沉 淀 加入0.45% NaCl 溶 液 混 合, 配制0.5 、1 、2 、3 、4 个单位麦 氏 浓 度 的 菌 悬 液 ,0.5 麦 氏 浓 度 菌 悬 液 再 以2 、5 、10 、100 倍 比 稀 释 。 各取上述 菌悬液1ml 于Eppendorf 管 中, 将10~20ml 4 个麦氏 浓度的菌 悬 液用Eppendorf 管分 装,130 000 rpm 离心3 min ,弃上 清, 取全部细 菌 18 泸州医学院硕士研究生学位论文 沉淀与饱 和SPA 混 匀, 将混合 液完全 点样于两Au 芯片 孔 上, 室温干 燥 5min ,每孔再 加3μl 饱和SPA ,自 然干 燥后上机 检测。 1.2.5 SELDI-TOF MS 检测细菌 蛋白的 重复性 选取一株 表皮葡 萄 球菌, 按照 方法1.2.2 中的步骤 进行培 养 和收集 , 后取各细菌沉淀30μl 与等量的饱和SPA 混合,分别点样两条Au 芯片, 每条芯片 点8 个点样 孔, 检测 细菌蛋 白 表达。 分 析同一Au 芯片不同 点 样孔之间和不同芯片点样孔之间细菌蛋白指纹图谱的差异,评 价 SELDI-TOF MS 检测细菌蛋白 的重复 性 。 1.2.6 分析不同培养 基对细菌 蛋白图 谱 的影响 以参考菌 株金黄 色 葡萄球菌 ATCC 12600 (革兰 氏阳性 菌 )、大 肠埃希菌 ATCC 25922 ( 革兰氏 阴性菌 ) 及铜绿假 单胞菌 ATCC 27853 (革兰氏 阴性菌 ) 为模式菌 株, 将 ATCC 12600 分别接 种 于血琼脂 培 养基、 巧克 力色血 琼脂培养 基、MH 琼 脂平板、 营 养琼脂 平板;ATCC 25922 和 ATCC 27853 分 别接种 于血琼 脂培养基 、加万 古 霉素巧克 力 色血琼脂培养基、麦康凯琼脂平板、MH 琼脂平板、营养琼脂平板, 在 35 ? 、6.5% CO 条件 下培 养 24h , 然后挑取 单个菌 落 接种新的 平 2 板,35 ? 、6.5% CO 培养 24h ,收集 适量纯菌 至装有 1ml 灭菌水 的 2 1.5ml EP 管中,13000 rpm 离心 3min , 灭菌水洗 涤两次 , 留取细菌 沉 淀用于质 谱检测 。 每株标准 菌每种 培 养基重复 16 个芯 片孔,重 复 3 天,每株 菌每种 培 养基共获 取 48 次 质 谱图。然 后分析 比 较培养基 对 细菌蛋白 表达的 影 响。 1.2.7 分析不同培养 时间细菌 蛋白指 纹 图谱的差 异 19 泸州医学院硕士研究生学位论文 以表皮葡 萄球菌 和 大肠埃希 菌各一 株 为例, 将 一株表 皮葡 萄球菌 接种血平 板, 一株 大 肠埃希菌 接种麦 康 凯平板分 别于第24h 、 48h 、 72h 收集细菌 , 按 照方 法1.2.2 中 的步骤 对 细菌进行 前处理 , 然后取10μl 细 菌沉淀与 等量的 饱 和SPA 混合, 点 样Au 蛋白 芯片, 每 个样 本重复点 样 四次。检 测其蛋 白 指纹图谱 有无差 异 。 1.2.8 同种细菌不同 菌株蛋白 表达的 稳 定性 为 验 证 在 相 同 培 养 条 件 下 同 种 细 菌 不 同 株 之 间 细 菌 蛋 白 表 达 是 否 稳定 ,表 皮葡萄球 菌、 鲍曼 不动杆菌 、大 肠杆 菌、肺炎 克雷 伯菌、 粪肠球菌 、 金黄 色 葡萄球菌 、 铜绿 假 单胞菌 、 屎肠球 菌 和阴沟肠 杆菌 各取10 株 , 将-80 ? 保 存 的 各 种 菌 株 和 参 考 菌 株 按 照1.2.2 的 方 法 进 行 培养和处 理后, 每 个样本重 复点样 四 次。 检 测细菌 蛋白 表达, 并 计算 其 主要蛋 白峰分 子 量的变异 系数。 1.3 结果 1.3.1 16S rRNA 基因测序鉴 定结果 各种菌株 均可扩 增 出目的片 段,大 小526bp (图1.1 )。 将 各 实 验 菌 株 目 的 片 段DNA 序列与GenBank 中 该 菌 株 基 因 序 列 进行Blast 比 对 , 一致 性 均?98% , 鉴 定为 相 应 的 细 菌 。测序 结 果 如 图 1.2 所 示。 20 泸州医学院硕士研究生学位论文 图1.1 16S rRNA 基因扩增凝胶成像 Fig1.1 PCR for 16S rRNA gene of nine species 注:M:Marker ;1: 表 皮 葡 萄 球 菌 ;2: 鲍 曼 不 动 杆 菌 ;3: 大 肠 埃 希 菌 ;4: 肺炎克雷 伯菌;5,6: 粪肠球菌;7,8: 金黄色葡萄球菌;9,10: 铜绿假单胞菌;11,12: 屎 肠球菌;13,14: 阴沟肠杆菌 图 1.2 9 种细菌 16S rRNA 基因测序结果图 Fig1.2 16S rRNA gene sequencing image of nine species 注:1: 表皮葡萄球菌;2: 鲍曼不动杆菌;3: 大肠 埃希菌 ;4: 肺炎克雷伯菌;5: 粪肠 球菌;6: 金黄色葡萄球菌;7: 屎肠球菌;8: 铜绿假单胞菌;9: 阴沟肠杆菌 21 泸州医学院硕士研究生学位论文 1.3.2 仪器分子量校 准结果 利用SELDI-TOF MS 检测蛋白标准品Insulin (MW5 733.49 ), CytochromeC (MW12 230 ),Myoglobin (MW16 950 ), 结果显示 校 准 品 蛋 白 峰 的 分 子 量 均 与 校 准 品 固 有 分 子 量 一 致 ( 图1.3 ) , 证 明 SELDI-TOF MS 能准确检测蛋 白质分 子 量。 图1.3 SELDI-TOF MS 检测校准品分子量 Fig1.3 MW of Calibrators detected by SELDI-TOF MS 1.3.3 SELDI-TOF MS 检测细菌 样品的 灵敏度 对含有不同细 菌菌 落个数的ATCC 29213 样 品进行质 谱检 测,结 7 果表明,SELDI-TOF MS 检测细 菌的检 测限为5 ×10 CFUs (图 1.4 ) 。 图1.4 SELDI-TOF MS 检测细菌样品的检测限 Fig1.4 Detection limit of bacteria by SELDI-TOF MS 22 泸州医学院硕士研究生学位论文 1.3.4 SELDI-TOF MS 检测细菌 蛋白的 重复性 细 菌 蛋 白 指 纹 图 谱 在 同 一 芯 片 不 同 的 点 样 孔 之 间 和 不 同 芯 片 孔 间有很好 的重复 性 (图1.5 )。 选取蛋白 质谱共 有 的10 个共 有的蛋 白 峰计算分 子量变 异 系数, 均 ?0.05% (表1.1 ) 。 显示SELDI-TOF MS 和Au 芯片 检测细 菌 蛋白的重 现性很好 。 图 1.5 表皮葡萄球菌蛋白质谱重复性 Fig1.5 Reproducibility of protein fingerprint of S.epidermidis between different spots of the same Au chip and different chips 注: 图中为表皮葡萄球菌 (N0.197 ) 点样于两 条Au芯片 (A-H ) , (a-h)各8个 点样孔的蛋白指纹图谱 23 泸州医学院硕士研究生学位论文 表1.1 ` Table1.1 Coefficient of variation of MW of protein peaks from identical strain ofS. epidermidi