第九章 目的基因的克隆

第九讲  目的基因的克隆 吴乃虎 （中国科学院遗传与发育生物研究所） 黄美娟 （北京大学生命科学学院细胞遗传学系） 目    录 一、基因克隆的一般概念 1． 基因克隆定义 2． “克隆”的不同含义 3． 基因克隆的过程 4． DNA片段的产生与分离 5． 基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1． 物理策略 2． 生物策略 3． 克隆样品的选择 4． 基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1． 概述 2． cDNA文库的构建 3． 低丰度mRNA之cDNA克隆 4． 稀少mRNA的cDNA克隆 5． 全长cDNA的合成 6． cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆 1． cDNA克隆的局限性 2． 基因组DNA克隆的优越性 3． 构建基因组文库的载体类型 五、基因定位定隆 1． 基因定位克隆概述 2． RFLP分子标记 3． RFLP作图原理与步骤 4． 染色体步移 5． 大尺度物理图谱的构建 目的基因的克隆 吴乃虎 （中国科学院遗传与发育生物研究所） 黄美娟 （                北京大学生命科学学院细胞遗传学系） 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 ，基因克隆的全过程包括如下四个步骤： a.DNA材料的选择与片段化； b.外源DNA片段与载体分子的连接； c.重组体分子的体外转化； d.转化子克隆的选择或筛选。 2．克隆的不同含义：(动词、名词与形容词) (1)“克隆”的三种含义 *1.“克隆”一词作名词时，是指从一个共同的祖先经无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特定的生命群体； *2.“克隆”一词作动词时，则是指从同一祖先经无性繁殖产生这类遗传分子上同一的DNA分子、细胞群体或个体群体的过程； *3.“克隆”一词除了用作名词和动词之外，还可用作形容词使用，例如“克隆羊”(cloned sheep)中的“克隆”便是形容词，这是中文的一个有别于英文的地方。 (2)名词“克隆”的三个内容 在作名词使用时，“克隆”涉及如下三个方面的内容： a.在胚胎学、免疫学以及细胞生物学等学科中，“克隆”一词是指是同一祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体； b.具有相同基因型的同一物种的两个或多个个体亦可用克隆表示，因此从同一个受精卵分裂而来的单卵双生子(monozygotic twins)便属于同一克隆； c.在分子生物学中，带有一段插入DNA序列的独特的寄主/载体单位(例如细胞寄主中的重组质粒载体)亦叫做克隆。 3．基因克隆的过程 a.DNA分子的体外切割——克隆用的DNA材料的片段化，它要求在其分子的准确部位切割DNA分子的实验方法，识别序列特异的核酸内切限制酶的发现为DNA分子的体外切割提供了有力的工具。(A method for cutting DNA at precise locations) b.DNA分子的体外连接——共价连接克隆DNA片段与载体分子的方法(A method for joining two DNA fragment covalently)    DNA连接酶的发现使这个问题得到了圆满的解决。 c.克隆载体的选择——选择能够自我复制的小分子量的载体DNA分子。(Selection of a small molecular of DNA capable of self-replication) 待克隆的外源基因或DNA片段，可以被连接到质粒或病毒载体的DNA分子上(克隆载体)。这些重组合的DNA分子是由两个或数个不同来源的DNA片段共价连接而成，称为重组体分子(recombinant DNAs)。 d.重组DNA的转化——将重组DNA分子从试管中转移到能使其进行DNA复制的寄主细胞的方法。(A method for moving recombinant DNA from test tube into a host cell that can provide the enzymatic machinery for DNA replication) e.转化子的筛选与鉴定——筛选或鉴定含有重组体DNA分子的寄主细胞的方法。(Method to select of identify those host cells that contain recombinant DNA) 4．DNA片段的产生与分离 我们知道所谓DNA文库(DNA library)是指，来自特定生物生命体基因组的全部DNA片段之每一条片段，都与克隆载本单独形成重组分子，此种包含有该特定生物生命体之全部DNA片段的重组克隆分子的集合体，称做DNA文库。简言之，是生物生命体的基因组DNA片段化之后形成的成千上万的DNA片段都被同一克隆载体所克隆。因此生物生命体的全部遗传信息通过基因文库(DNA文库)中的各种克隆得到了保存与体现，犹如书库保藏着人类的全部知识一样。由此可见，基因克隆与分离的头一步就必须对基因组DNA进行片段化。 (1) 核酸内切限制酶的切割法 真核基因组DNA经核酸内切限制酶消化之后不进行凝胶电泳分部分离而直接与克隆载体重组，这种克隆方法，在早期研究中使用过，特称为“鸟枪法(shotgun approach)”。 缺点：①形成的重组体分子，实际上是一群带有不同大小的插入片段的重组载体的混合群体。造成目的基因筛选困难、工作量大、费时、费力、费钱。 ②有些目的基因的核苷序列中可能会存在一个甚至数个限制酶识别位点。因此，克隆的目的基因有可能被切成若干片段。 ③产生的有些片段可能太大，有些片段又可能太小，因此有些基因无法被克隆，形成不完全的基因库。 (2) 机械切割法 构建DNA文库最好使用随机片段化的方法制备DNA的克隆片段。机械切割法和限制酶局部消化法处理基因组DNA，都可以产生出随机片段化的DNA克隆片段群体； 机械切割的标准状况是：1500转/分搅拌器中高速搅拌，30分钟便可将DNA分子切成平均长度8kb的分子群体。 (3) 限制酶局部消化 用来产生DNA克隆片段的限制酶，必须考虑到它对DNA序列应该具有最佳的识别位点分布规律。例如选用噬菌体载体构建基因文库，就不能够承载大小25Kb的EcoRI片段，在这种情况下最好选用识别序列为4bp的Sau3A、HaeⅢ以及AluI等限制酶。 (4) DNA片段的大小分部 *蔗糖密度梯度离心——除去不适于克隆的过大或过小的DNA片段； *琼脂糖凝胶电泳——此法可以在很窄的范围内获得高纯度的某种DNA片段，或是大小同源的DNA片段。此法的缺点是，琼脂糖的污染有时会抑制尔后的酶催反应。 5．基因文库 (1)基因文库和DNA文库 *基因文库亦叫基因银行(Gene bank)，系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物、组织、器官或细胞类型的所有的DNA片段而构成的克隆集合体。在理想的情况下，它应包含有该生物种全部的遗传信息。在过去也称基因文库为鸟枪收集。 *DNA文库(DNA library)，基因文库是在基因工程诞生的早期就已被使用，已经习惯且通俗易懂。但近年来一般称基因文库为DNA文库，这是一种更加符合实际更加科学的名称。因为基因文库从本质上讲是由来自染色体基因组的全部DNA片段组成的。 (2) 基因组文库和cDNA文库 *基因组文库(Genomic library)，系指生物体基因组DNA经过核酸内切限制酶作部分消化切割之后，克隆在适当的载体分子上，然后将这重组的混合物转化给例如大肠杆菌这样的寄主菌株，于是便构成了包含该生物体整个基因组全部遗传信息的基因组文库。 *cDNA文库(cDNA library)，将纯化的某种生物的特定发育阶段或组织之mRNA，经反转录酶作用合成双链的DNA群体，同适当的载体分子重组之后转化给寄主菌株，如此便构成了特定的cDNA文库。这种文库与基因组文库不同，它只包括特定的发育阶段特定组织或器官中表达的基因，而不是全部的基因。 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略(physical strategy) 基因的克隆与分离从大的方面看，可以区分为物理策略和生物策略两大类。 所谓物理策略是，首先构建基因组的物理图谱，如限制图和测序图，然后再据此确定基因的位置、全序列结构、表达蛋白质及其生物功能。 基因组DNA是一种线性结构，使用物理策略分离目的基因，是按照染色体、YAC克隆(或BAC克隆)、Cosmid克隆、亚克隆这种由大到小的过程，逐渐克隆、分离和测序，最后完成目的基因及其基因组的全测序。 2．生物策略(biological strategy) 从具有某种表型(生物功能)的个体或细胞的基因组中，分离出与表型相关的基因片段，再以此为分子探针，筛选出基因的全序列和表达序列。以这种方式克隆分离目的基因的策略，称为生物学策略。 3．克隆样品的选择 (1) 蛋白质大分子 最早的功能基因克隆，是从分离纯化与特异表型相关的蛋白质开始的，然后根据蛋白质的氨基酸顺序反推出相应的核苷酸顺序，并以此为依据合成分子探针，从基因库中筛选出目的基因。 *1.优点： 一般真核细胞中蛋白质种类的复杂度都比较低，仅有104种左右，故可比较容易地通过电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 得到间断的可分辨的图谱。因此，对于一些大量表达的功能蛋白质之编码基因的分离，还是比较容易的。 *2.缺点： 在任何类型的细胞中，都仅有少数基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还随着发育阶段的不同及环境因素的变化而变化，所以在不同的发育阶段和不同的环境条件下，不同类型的细胞中蛋白质的种类都是不完全的，也不尽然相同。 况且还有许多基因的蛋白质产物是未知的，或者其纯化量不足以进行氨基酸序列分析及相应抗体的制备。因而要从蛋白质水平来分离目的基因，显然也是有困难的。 (2) mRNA大分子 *高等真核生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定的发育阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生出大约15000种不同的mRNA。可见mRNA的复杂度与蛋白质的复杂度比较接近。 *正是由于这种基因的差别表达，才决定了高等植物的发育分化、细胞周期、对环境压力的反应，以及衰老与死亡等所有的生命过程。 *植物的正常代谢过程或者病理变化，以及光温的育性效应，不管其是由单基因控制的，还是由多基因控制的，本质上都是由于基因表达的改变造成的。因此，比较不同的细胞或不同基因型的基因表达的差别，为我们了解植物的发育分化的分子本质，以及克隆分离与此相关的基因打开了方便之门。 *从mRNA出发克隆分离目的基因的技术程序： a. 差别杂交技术(differential hybridization) b. 扣除文库技术(subtracted library) c. mRNA差别显示(mRNA differential display) d. 代表性差别分析法(representational difference analysis，简称RDA；中文又译作cDNA差式分析法) (3) DNA大分子 真核生物基因组DNA的复杂度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。因此无论是采用电泳分离技术还是通过杂交方法，都是难以直接分离到目的基因(或其片段)的。 但基因组DNA具有完整性(包括protein和mRNA分子所不具有的非编码区序列)、恒定性(在单克隆细胞群体中，基因组DNA序列的种类和数量都是恒定的)、可直接进行克隆、序列分析及杂交识别，因此是分离基因的主要样品(出发材料)。 以DNA为出发材料分离目的基因的优点： a. 可以分离到完整的基因结构序列，包括外显子和内含子以及启动区序列等； b. 数量恒定，不会受到生物体发育状态、发育阶段以及不同器官组织的影响； c. 不必经过反转录或是氨基酸测序合成引物等程序，便可直接进行基因克隆； d. 可直接进行核苷酸序列分析； e. 可直接进行核酸杂交鉴定； 4．基因文库库容测算 (1) 理论克隆数与实际克隆数 由某种生物材料构建的完全的基因组DNA之基因文库，所应具有的理论克隆数和实际克隆数是有相当差别的。 *1. 理论克隆数： 是用给体生物(例如细胞、真菌及动物或植物)的基因组DNA总量(分子量大小)，除去克隆片段的平均大小所得的数值。 理论克隆数受两个因素的影响，其一是给体生物基因组分子量的大小；其二是克隆片段的平均分子量，亦即是所用的克隆载体可能承接的外源片段的克隆能力。 *2. 实际克隆数： 由于DNA片段是随机克隆的，因此理论克隆数只是基因组文库所需的最小数值。从统计学上讲，这意味着从一个只含有最低重组体DNA克隆数的基因库中，筛选一种特定的单拷贝基因只有50%的几率。 而当被筛选的基因库是含有两倍的最低重组体DNA克隆时，那么获得某一特定基因的几率则可达75%。因此，为了达到以一种合理的几率筛选出单拷贝目的基因，一个完全的基因文库就必须含有3-10倍于最低重组体DNA克隆数。这个实际克隆数是由Clarke-Carbon公式计算。 表9-1 不同生物的完全基因组DNA之基因文库应具有的 理论克隆数和实际克隆数 克隆片段之平 均分子量大小 (bp) 基因组大小(bp) 2×106(细菌) 2×107(细菌) 3×109(细菌) 理论 克隆数 实际 克隆数 理论 克隆数 实际 克隆数 理论 克隆数 实际 克隆数 5×103 400 1831 4000 18418 600000 2763110 10×103 200 919 2000 9208 300000 1381550 20×103 100 458 1000 4603 150000 690774 40×103 50 278 500 2300 75000 345386               (2) Clarke-Carbon公式： 这是在1975年由L. Clarke和J. Carbon提出的一种计算一个完全基因文库所需要的实际克隆数的公式。上表所例的实际克隆数就是按照这个公式计算的。 N= ln(1-p) ln(1-f)     N=一个完全基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数(实际克隆数)； P=重组体群体中出现目的基因序列的几率(一般期望为99%)； f=为限制片段的平均大小与基因组总量之比值； 以人-珠蛋白基因(分子量约为1.5Kb)为例，其N值应是： N= ln(1-0.99) =9.2×106 ln[1-(1.5×103/3×109)]       *这个数字表明，如果使用的载体不具有选择记号，那么就需要分离并鉴定9×106个独立的菌落或克隆。 *换句话说，我们必需拥有非常大量的重组体的DNA群体，才有可能汇集整个人基因组的全部DNA序列。 要分离鉴定如此大量的克隆(9百万个克隆)，再考虑到连接作用及转化两者的效率，那么要在一次实验中产生如此大量的重组体的可能性，无疑是微乎其微的。克服的办法是选用克隆能力大的载体建库： a. 应用克隆能力为15kb(即插入片段平均分子量为15kb)的载体，那么一个完全的基因文库所需的重组体数量便可下降到9×105； b. 如选用克隆能力为40kb的柯斯载体，这个数字还可以进一步下降到3.5×105； 三、cDNA基因文库 1．cDNA基因克隆概述 真核生物基因组DNA十分庞大，以人的为例高达3×109bp，而且含有大量的重复序列。因此无论是用电泳分离技术，还是通过杂交的方法，都是难以直接分离到目的基因片段。这是以真核染色体基因组DNA为出发材料直接克隆目的基因的困难所在。 cDNA基因克隆可以部分解决上述的困难，这是因为它的复杂度仅及基因DNA的1%左右。cDNA基因克隆的基本过程是通过一系列的酶催反应，使总poly(A)mRNA→双链cDNA→与适当载体分子重组→转化给寄主菌株细胞。如此便构成了cDNA基因文库，此种技术已成为当今研究真核生物分子生物学及基因工程的基本手段之一。 2．cDNA文库的构建 第一步：分离细胞的总RNA，并根据其3-端具有poly(A)尾巴的特征，应用oligo(dT)法，从中纯化出主要含mRNA的分部 第二步：合成第一链cDNA，即以mRNA分子为模板加上适当的引物，引导反转录酶合成第一链cDNA。常用的有oligo(dT)引物法，和随机引物法。 第三步：将mRNA-DNA杂交分子转变为双链DNA分子，其具体的办法有： a. 自我引导合成法， 系用碱处理使mRNA模板水解，并在第一链cDNA末端形成发夹结构作为第二链合成的引物； b.RNaseH降解法 该酶可识别mRNA-DNA杂交分子，并将其中的mRNA模板消化成许多短片段 第四步：将双链DNA同适当载体分子重组，并导入寄主细胞增殖，于是便构成了cDNA文库。体外重组的方法有： a. 用末端转移酶给双链cDNA分子作同聚物加尾； b. 加adapter或linker； 3．低丰度mRNA的cDNA克隆 (1 )mRNA丰度 在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。有些类型mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千拷贝；有些类型mRNA则相当稀少，每个细胞仅有少数几个拷贝。 所谓mRNA丰度，系指一个细胞 中某种特定mRNA分子拷贝数的多寡，即通常所说的丰富程度。据此可将mRNA分成高丰度、中丰度和低丰度三种不同的类型。 表9-2 一种典型的真核细胞mRNA群体的丰度等级及其复杂性 丰度等级 相应丰度等级的mRNA群体占总mRNA的百分数 在相应丰度等级中所含的不同种类mRNA序列数目(个) 每个细胞所含的相应丰度mRNA序列的拷贝数(个) 高丰度 22 30 3500 中丰度 49 1090 230 低丰度 29 10670 14         (2) 高丰度mRNA的cDNA克隆 有些基因的mRNA含量相当丰富，例如： 胰脏组织中的——胰岛素基因的mRNA； 血红蛋白细胞中——珠蛋白基因的mRNA； 鸡输卵管中——卵清蛋白基因的mRNA。 从这些组织或细胞中分离出来的总mRNA，不需进一步纯化，就可直接用来合成双链DNA，并构建基因文库，分离上述这些目的基因。因此说，分离高丰度的mRNA的目的基因之cDNA克隆，实际上并不存在什么困难。例如应用digo(dT)纤维素层析法，就可以从富含poly(A)mRNA制剂中纯化出珠蛋白mRNA。 (3)低丰度mRNA的cDNA克隆 对于低丰度的mRNA的cDNA克隆，通常是构建cDNA基因文库。组成一个合理的、完全的cDNA基因文库所必须的重组体克隆的数目，可以根据Clarke-Carbon公式计算。在典型的情况下，对大多数的低丰度mRNA，建立105个克隆就已足够了。 大体上讲来，在一定的发育阶段，哺乳动物的细胞含有10000到30000种不同的mRNA序列。例如人成纤维细胞大约有12000种不同的mRNA序列。 从表9-2可以看到，低丰度的mRNA每个细胞仅有14个拷贝左右，其总量约占总mRNA的30%，其中约有11000个左右不同种类的mRNA。因此，为获得一个能够代表全部低丰度mRNA的序列的cDNA基因文库，所必须的最低克隆数(理论值)应是11000/0.30=～37000。 但考虑到在①实验取样的差异；②以及有些序列容易克隆，有些序列不易克隆等因素，因此就必须增加克隆数目。以人成纤维细胞为例，为使其中某些特异的低丰度mRNA之cDNA克隆达到99%的期望率，按Clarke-Carbon公式计算需要170000个克隆。 这个数字是目前实验技术所能达到的。因为无论是用同聚物加尾法，还是双衔接物法，每微克的双链cDNA都可以产生出1×105～6×105个的菌落。 4．稀少mRNA的cDNA克隆 一些含量极低的稀少mRNA的cDNA克隆，是无法应用菌落原位杂交技术检测的。根据一些作者的计算，使用体外标记的mRNA或cDNA作探针，可以检测出仅占总mRNA 0.05%～0.1%低丰度的mRNA的cDNA克隆。然而在实际操作中，要检测出含量不到总mRNA 0.5%的低丰度mRNA之cDNA克隆，仍有极大的困难。 下面介绍一些解决稀少mRNA的cDNA克隆的方法。 (1)分部分离法 应用按分子量大小分部分离技术富集克隆的mRNA，其常用的方法有： a. 蔗糖梯度离心法； b. 变性凝胶电泳法。 (2) 寡聚脱氧核苷酸纯化法