下游技术(工程):
对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料,经提取分离、加工并精制目的成分,最终使其成为产品的技术。
物质分离和产品加工
生物工业下游技术的发展历程
1.古代酿造业
古代酿造业包括酿酒、制酱(油)、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用,无下游技术。
2. 第一代生物技术
主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用,掌握了纯种培养技术,生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶,逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业(厌氧发酵),其产品相对简单,基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。
3. 第二代生物技术
以20世纪40年代出现的青霉素产品为代
表
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。
无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发,一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产,如抗生素(链霉素)、氨基酸(谷氨酸)、有机酸(核酸、柠檬酸)、酶制剂(淀粉酶)、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术,如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。
4. 第三代生物技术
以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。
生物技术在其主要领域:基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步,一批高附加值的产品开始面世,如乙肝疫苗、干扰素等。80年代,发现了一大批生理功能性物质,如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等,生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱(层析)技术等。
一般下游加工过程可分为4个阶段
1) 预处理和固液分离;
2) 初步纯化(提取);
3) 高度纯化(精制);
4) 成品制作
生物工业下游技术的发展动态
成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力
1. 传统分离技术的提高和完善
适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后,适应面更宽,效率会更高,仍然显示出强劲的生命力。
各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世,结晶理论和离子交换技术的新进展,提高了产品的收率、质量和生产效率。
2. 新技术的研究开发
1)新型分离介质的研究开发
膜(膜材料和膜制造工艺)、树脂(离子交换树脂和大网格树脂)和凝胶(琼脂糖凝胶为基质,与各种配基结合后制成各种色谱分离介质)是目前主要的新型分离介质。
2)子代分离技术
各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透,形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术;色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。
3)其他新兴下游技术
由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术,如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取(细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离);菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。
发酵液的基本特性
? 发酵产物浓度较低,大多为1-10%,
? 悬浮物颗粒小,细胞的相对密度与培养液相似。
? 固体粒子可压缩性大
? 液相粘度大,大多为非牛顿型流体;
? 悬浮状态稳定:双电层、水化膜、布朗运动
? 固液分离方法主要是过滤和离心。
预处理的目的:
降低液体黏度(加水稀释、加热),促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率:
⑴ 改变发酵液的物理性质,包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸,降低液体黏度。
⑵ 相对纯化,去除发酵液中的部分杂质(高价无机离子和杂蛋白质),以利于后续各步操作。
⑶ 尽可能使产物转入便于后处理的一相中(多数是液相);
预处理的方法
凝聚和絮凝
高价无机离子的去处
加热法
调节悬浮液的PH值
杂蛋白的去处
助滤剂和反应剂
双电子层:发酵液中菌体表面带有负电荷,由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围,在界面上形成了双电层。
凝聚:指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层电排斥作用降低,电位下降,而使胶体体系不稳定的现象;相互聚集成大粒子(1mm)的过程。
凝聚机理:
1)中和粒子表面电荷
2)消除双电层结构
3)破坏水化膜
絮凝:指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用
机理:架桥作用
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,其相对分子质量可高达数万至一千万以上,长链状结构,其链节上含有许多活性官能团,包括离子基团以及非离子型基团。
● 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。
● 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上,产生架桥联结时,就形成较大絮团,产生絮凝作用。
絮凝的影响因素
? 发酵液的性质(细胞浓度,表面电荷);
? 絮凝剂的浓度,(最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖;)
? 絮凝剂的分子量;
? pH 控制;
? 搅拌速度。
包括凝聚和絮凝机理的过程,称为混凝。
? 对于带负电荷的菌体或蛋白质来说,采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理,单独使用可达到较好絮凝效果;
? 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂,要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。
助滤剂
发酵液的相对纯化
A. 高价无机离子(Ca2+、Mg2+、Fe2+)在采用离子交换提炼时,会影响树脂对生化物质的交换容量。
(一)高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠,→形成草酸钙沉淀(注意回收草酸) ;
2. Mg2+——三聚磷酸钠,→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物; Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na
3. Fe2+——黄血盐,→普鲁士兰沉淀
4. 3K4Fe(CN)6+4 Fe2+ =Fe4[Fe(CN)6]3+12K+
B. 杂蛋白
常规过滤或膜过滤时,易使过滤介质堵塞,影响过滤效率。
采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力,
有机溶剂法或双水相萃取时,易产生乳化,使两相分离不清。
(二)杂蛋白的去除方法
沉淀法
A 等电点沉淀法
B. 酸碱调节,使蛋白质与离子形成沉淀
变性法
● 加热,
● 大幅度调节pH值,
● 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
吸附法
常见的固液分离方法
? 过滤
? 离心
? 膜分离
? 双水相萃取 ATPS
? 扩张床吸附 EBA
过滤速度的强化
1.降低滤饼比阻力rB
? 一切能够降低rB的方法:如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等。
2.降低滤液黏度μ
? 黏度愈低,过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调PH、选择合适的放罐时间。
3.降低悬浮液中悬浮固体的浓度
? 过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度(如玉米粉、豆饼粉的浓度)。
5. 对发酵液进行预处理,改善滤液性质。
细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜
? 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构,网状结构越致密,破碎的难度越大,革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固;
? 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度;
? 霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构,其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下:降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
酶溶法
(1)外加酶法
对酵母细胞采用酶法破碎时,先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构,使二者溶解,再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层,最后只剩下原生质体,这时若缓冲液的渗透压变化,则细胞膜破裂,释出胞内产物。
(2)自溶法(Autolysis)
◆ 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力,以达到细胞自溶的目的。
化学渗透法化学试剂作用
(1)表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解,其增溶作用有助于细胞的破碎。
(2)EDTA螯合剂
处理G-细菌,对细胞外层膜有破坏作用。
(3)有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂,使胞壁膜溶胀,细胞破裂,胞内物质被释放出来。
(4)变性剂
盐酸胍(Guanidine hydrochloride)和脲(Urea)是常用的变性剂。
变性剂与水中氢键作用,削弱溶质分子间的疏水作用,从而使疏水性化合物溶于水溶液。
化学渗透法优点:
● 对产物释放有一定的选择性,可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过,而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内;
● 细胞外形完整,碎片少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取。
缺点:
● 通用性差;
● 时间长,效率低,一般胞内物质释放率不超过50%;
● 有些化学试剂有毒
破碎技术的研究方向
1.多种破碎方法相结合
化学法、酶法、机械法相结合。
2.与上游过程相结合 在发酵培养过程中,培养基、生长期、操作参数(如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等)等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。
3.与下游工程相结合 细胞破碎与固液分离紧密相关。
溶剂萃取法:利用物质在互不相溶的两相溶剂中溶解度的不同,将物质从一相溶剂转移到另一相溶剂中,从而进行分离、浓缩和提纯目的产物的方法.
溶剂萃取:
①萃取 : 溶质从料液转移到萃取剂的过程。
②反萃取:溶质从萃取剂转移到反萃剂的过程。
在 完成萃取操作后,为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施,将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取
③物理萃取和化学萃取:物理萃取的理论基础是分配定律,而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡定律。
分配定律:一定T、P下,溶质在两个互不相溶的溶剂中分配,平衡时,溶质在两相中浓度之比为常数。
K-分配系数
在常温常压下K为常数;应用前提条件
(1) 稀溶液
(2) 溶质对溶剂互溶没有影响
(3) 必须是同一分子类型,不发生缔合或离解
萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素来表征。
分离因素(β)表示有效成分A与杂质B的分离程度。
KA
β=