加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响 加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心 肌细胞凋亡的影响 辽宁中医杂志2006年第33卷第9期?1205? 加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响 靳秀明.刘贵京..王庆书..连玲霞.商淑慧.梁艳玲 (1.邯郸市中医院,河北邯郸056001;2.河北工程大学,河北邯郸056029) 摘要:目的:观察加减瓜蒌薤白半夏汤对实验性心肌缺血大鼠细胞凋亡的影响, 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 其对心肌的保护作用,为中药 在抗心肌缺血方面的开发利用提供科学依据. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :分别用加减瓜蒌薤白半夏汤(中药组)和生理盐水(对照组)灌胃, 以结扎冠脉方法制备心肌缺血模型,应用流式细胞仪(FcM)及免疫组化观察心肌细胞凋亡及凋亡相关基因BCL一2和 Bax蛋白的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达,同时监测血清SOD及心肌组织MDA的含量.结果:再灌注4小时中药组与对照组相比缺血心肌细胞 凋亡率(4.14%?1.25%,16.78%?1.47%)(P<0.01);Bax蛋白表达明显减少(6.65%?2.06%,17.98%?5.14%) (P<0.01);心肌BCL一2蛋白表达显着升高(14.13%4-3.13%,7.11%?2.10%)(P<0.01);Bax和BCL一2的比值 亦随之下降(0.62%?0.24%,3.29%?0.11%)(P<0.01);中药组血清SOD含量高于对照组(0.69?0.12,0.32?33. 7)(P<0.01);心肌组织MDA含量显着低于对照组(3.15? :加减瓜萎薤白半夏 0.24,4.564-0.54)(P<0.01).结论 汤能减少再灌注损伤导致的细胞凋亡,其机制之一可能与提高血浆SOD活性,减少脂质过氧化反应,下调Bax蛋白表 达.上调Bcl一2蛋白表达有关. 关键词:加减瓜蒌薤白半夏汤;大鼠;再灌注损伤;细胞凋亡 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1000—1719(2006)09—1205—02 心肌缺血再灌注损伤(ischemia—reperfusioninju— ry,mi)是冠状动脉再通后一个重要的并发症,细胞凋 亡(apoptosis)则可能为IRI发病机制中的一个重要环 节.如何抑制IRI导致的心肌细胞凋亡,从而减少心 肌细胞丢失,保护心功能,已成为冠心病研究的热点之 一 0 以往研究证实加减瓜蒌薤白半夏汤可显着抑制缺 血心肌细胞Ca"超载,减轻心肌损伤,对缺血心肌组 织有显着的保护作用….本试验在以往研究的基础 上,进一步观察了该方对缺血再灌注心肌细胞凋亡及 凋亡相关基因BCL,2和Box蛋白表达的影响,并探 讨其抑制心肌细胞凋亡的可能机制. 1材料和方法 1.1动物SD大鼠24只.体重250g左右,雌雄 兼用.由河北医科大学动物实验中心提供. 1.2药物加减瓜蒌薤白半夏汤由传统中药瓜蒌 皮20g,薤白10g,半夏9g,川芎10g,当归12g组成,乙醇 提取,浓度为1g/mL,2mL,由河北工程大学附属教 学中医院制剂室制备. 1.3试剂与设备SOD,MDA试剂盒均购自南京建 成生物工程研究所,RM一6000多导生理记录仪由日 本光电公司生产;DH一动物人工呼吸机由浙江医科大 学生产. 每组8 1.4分组将实验动物随机分为三组( 只),假手术组,对照组(再灌注组)和中药组. 1,5实验步骤预适应饲养1周后,假手术组和对照 组,给予0.9%氯化钠溶液5ml/kg?d灌胃10天;中 药组,给予加减瓜蒌薤白半夏汤10g/kg?d灌胃10 收稿日期:2006—04—28 基金项目:河北省教育厅科研资助项目(2001—151) 作者简介:靳秀明(1963一),女,河北邯郸人,副主任医师,学士,主要从 事中西医结合临床研究. 天,末次灌胃后1h,以戊巴比妥钠60rag/kg腹腔注射 麻醉,将大鼠仰位固定于手术台,用针形电极插于四肢 皮下,连接多导生理记录仪;气管切开,连接动物人工 呼吸机;自左侧3—4肋间开胸,暴露心脏,于肺动脉圆 锥及左心房间找出冠脉左前降支,假手术组用无损伤 圆针穿过冠脉前降支但不结扎,术后旷置4h40min;对 照组和中药组在冠脉下穿以0号线,结扎,10min后松 开结扎线,复灌.持续记录心电图变化,以心电图出现 ?导联ST段(J点)抬高与高耸的T波融合呈锯齿状 改变及出现心律失常为缺血标志.复灌后4小时取静 脉血抗凝,离心,低温保存送检.另取材作心肌细胞凋 亡及基因蛋白表达的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 . 1.6观察指标流式细胞方法测定细胞凋亡率:将 70%乙醇固定的心肌组织用机械法分离,收集单细胞 悬液,经100目尼龙网过滤离心,沉淀5min,加生理盐 水洗涤,再次离心沉淀后,用溴化乙锭一步插入法进行 DNA染色,由流式细胞仪(FACScaliburBecton—Dick. inson)测定.仪器事先用鸡红细胞标定,使其变异系 数<5%.将所得数据输入计算机,经Cellquest专用 软件处理,分析细胞的凋亡率. 心肌组织Bcl一2,Box蛋白表达的免疫组化测定: 采用链酶亲和素一生物素,酶复合物(streptavidin— biotincomplexSABC)免疫组化检测Bcl一2(或Box)蛋 白的表达.主要流程如下:切片脱蜡入水一1%过氧化 氢封闭PODlOmin--~山羊血清封闭一加Bcl一2(或 Box)蛋白的抗体,4?过夜一滴加小鼠抗地高辛,再滴 加生物素化羊抗小鼠IgG,37?,30min一加SABC,用 DAB显色一苏木素复染一水洗,封片一镜检.阴性对 照不加抗体,阳性对照用已知阳性片,阳性判断标准: 以细胞浆着棕黄色为阳性,用计算机图像处理系统,每 次随机选l0个视野,测定细胞阳性染色的OD值与阳 性细胞百分比,计算蛋白阳性表达指数(positiveex— pressionindex,PEI),PEI=0D值×阳性细胞百分比× ? l206? 100,并计算Bax和Bcl一2的比值. 心肌组织MDA,血浆SOD含量的测定:严格按照 试剂盒操作规程进行. 1.7统计学方法全部计量资料以均数?标准差 (X?s)表示,以spss9.0forWindows,Excel2000软件 包作统计学分析并制作图表,组间差异比较采用方差 分析,P<0.05为显着性标准. 2结果 2.1加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠缺血再灌注心肌细 胞的影响由流式细胞仪测得心肌缺血区心肌细胞凋 亡率,对照组16.78%?1.47%,治疗组4.14%? 1.25%,两组间存在显着性差异(P<0.O1);而非缺 辽宁中医杂志2006年第33卷第9期 血心肌组织的凋亡率为0.89%?0.11%. 2.2加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠心肌组织Bcl一 2Bax蛋白表达的影响见表1. Bcl一2和Bax蛋白表达的部位与凋亡细胞分布 相似.在假手术组中Bcl一2,Bax的PEI都较低,Bax/ Bcl一2接近1;对照组Bcl一2和Bax的PEI均有所上 升.以Bax蛋白表达更明显,Bax/Bcl一2明显高于假 手术组(P<0.01);中药组与对照组相比,Bcl一2的 PEI上升更明显(P<0.01),Bax的PEI明显下降(P <0.01),Bax/Bcl一2也低于对照组(P<0.01). 表1加减瓜蒌薤白半夏汤对大鼠心肌组织MDA血浆SOD和心肌细胞凋亡及 Bcl-2Bax蛋白表达的影响(n=8,?) 2.3加减瓜蒌薤白半夏汤对血清SOD心肌组织 MDA的影响见表l. 再灌注4h两组大鼠血清SOD,心肌组织MDA的 差别有统计学意义(P<0.O1). 3讨论 细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(programmed celldeath,PCD).大多数研究表明,细胞凋亡的触发 是一个级联式基因表达的结果,有许多基因参与这些 过程,主动合成新的大分子蛋白质,对凋亡的发生,发 展起到促进或抑制作用J.Bcl一2家族作为主要的凋 亡调控蛋白而引起人们的重视.其中Bcl一2蛋白同 源二聚体抑制细胞凋亡,Bax蛋白同源二聚体则促进 细胞凋亡,因此,Bcl一2蛋白表达多则Bcl一2蛋白同 源二聚体升高,细胞趋向成活,反之,Bax蛋白同源二 聚体升高,细胞趋向凋亡,所以,Bax和Bcl一2表达的 比例才是决定细胞是否凋亡的关键. 有研究表明缺血后再灌注虽然使心肌得到了氧供 应,但同时增加了氧自由基的形成,加重了钙离子的超 载,从而触发了心肌细胞凋亡的始发环节及核酸内切 酶激活途径,引起细胞凋亡.大量氧自由基的产生 及清除障碍导致Bax和Bcl一2蛋白表达比例失调,从 而促进细胞凋亡.而心肌细胞过度凋亡,数量失衡也 会加重心肌的破坏和功能障碍J.本实验亦表明在 IRI时,SOD明显下降,组织中MDA含量大量增加,Bcl 一 2蛋白表达上调,但Bax蛋白表达上调更多,Bax和 Bcl一2的比值显着增高,凋亡细胞率增高,凋亡细胞 数量增多. 瓜蒌薤白半夏汤是汉代名医张仲景的着名方剂, 具有通阳散结,豁痰下气的功效.笔者遵循中医理论 在仲景原方基础上进行加减,去白酒,加川芎,当归组 成了加减瓜蒌薤白半夏汤.方中瓜蒌开胸涤痰;薤白 通阳散结;半夏逐饮降逆,祛痰开结;加入川芎,当归以 增强其行气活血,散寒止痛之功效. 现代研究发现瓜蒌薤白具有扩张冠脉,增加冠脉 血流量,抑制血小板聚集,促进血小板解聚和提高动物 耐缺氧能力的作用,且二者有协同作用.但对抗IRI 时细胞凋亡的作用研究较少.而当归注射液有增强血 超氧化物歧化酶活性,降低脂质过氧化反应,并能降低 MDA水平;川芎能抑制冠脉痉挛,增加冠脉血流量,降 低心肌耗氧量和抗脂质过氧化作用j,说明其对缺血 再灌注引起的损伤有明显的保护作用. 本实验研究结果证实,中药组血清SOD活性明显 高于对照组,组织MDA含量,心肌细胞凋亡率,Bax蛋 白表达明显减少,Bcl一2蛋白表达上调,Bax和Bcl一2 的比值亦随之下降,说明该方具有减少IRI导致的细 胞凋亡的作用其机制之一可能与提高血浆SOD活性, 减少脂质过氧化反应,下调Bax蛋白表达,上调Bcl一2 蛋白表达有关.但确切机制有待进一步探讨. 参考文献: [1]刘贵京,张禄其,马力国,等.加减瓜萎薤白半夏汤抗缺血心肌再 灌注损伤的实验研究[J].中国全科医学,2004,7(8):541 [2]乌仁,陈忆九.细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤研究现状[J].法 医学杂志,1999,15(1):57 [3]RezvaniM,BarransJD,DaiKS,eta1.Apoptosis—RdatedgeneseX? pressedincardiovasculardevelopmentanddisease:811ESTapproach [j].CardiovascularRes,2000,45:621 [4]李国营,刘靖,田索民,等.兔实验心肌缺血再灌注损伤与心肌细 胞凋亡的关系[J].解剖学研究,2004,26(1):37 [5]CardenDI,GrangerDN.Pathophysiogyofischaemia—repeffusionin— jury[J].JPathol,2000,190:255 [6]巢元茂,何波瓜蒌薤白汤研究概况[J].中国实验方剂学杂志, 1999,5(1):57 [7]沈映君.中药药理学[M].北京:人民卫生出版社,2000.632,921 — 922