巨型艾美耳球虫配子体GAM56基因的克隆与表达

巨型艾美耳球虫配子体GAM56基因的克隆与 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 巨型艾美耳球虫配子体GAM56基因的克隆 与表达 l2中国兽医杂志2007年(第43卷)第11期 巨型艾美耳球虫配子体GAM56基因的克隆与表达 张晓燕,丁隽,刘群 (中国农业大学动物医学院,北京海淀】00094) 中图分类号:Q786文献标识码:B文章编号:0529, 6005(2007)11-0012-03 目前报道的鸡球虫有7个种,其中巨型艾美耳 球虫具有较强的致病性,而且是鸡体内致病性球虫 中免疫原性最强的球虫,只需要几个卵囊就可以产 生较好的保护能力|1].后来的研究也发现用纯化的 巨型艾美耳球虫配子体抗原免疫的鸡可产生明显的 保护性抗体,最重要的是这种抗体可作为母源抗体 传递给子代,对子代产生几乎完全的保护力,并可持 续3个月之久l2一.而且,使用巨型艾美耳球虫进行 免疫可以对其他种类球虫产生交叉保护力]. 本课题组曾对柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球 虫进行功能抗原基因的克隆,表达和抗原性研究,取 得了较好的结果.本研究克隆出巨型艾美耳球虫扬 州株的配子体抗原GAM56的基因片段并进行体外 表达,为进一步研究巨型艾美耳球虫配子体抗原的 免疫原性以及研制基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 多价疫苗奠定基础. l材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1材料 1.1.1虫株E.maxima扬州株孢子化卵囊由扬 州大学陶建平教授馈赠,本实验室繁殖并保存. 1.1.2菌株与载体大肠杆菌JM109,BL2l,表达 载体pGEX一6p—l均为本实验室保存;克隆载体 pGEM—TEasy购自Promega公司. 1.1.3分子生物学试剂Trizol试剂购自北京博 大泰克生物基因技术公司;限制性内切酶EcoRI, BarnHI,T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品; MMLV,PCR产物纯化试剂盒,质粒小提试剂盒均 购自北京赛百盛公司. 1.2方法 1.2.1E.maxima配子体的收集 1.2.1.1SAC溶液NaC14.9674g,CaC12?2H2() 0.3676g,葡萄糖0.991g,BSA0.5g,加人lMpH 7.oNTris,HC1缓冲液5mL及485mL蒸馏水,使用 时再加入10mL50mM的PMSF储存液. 1.2.1.2收集E.maxima扬州株孢子化卵囊感 染鸡后l32h,取小肠中段,用透明质酸酶终浓度为 0.5mg/mL的SAC溶液灌肠,两端系住后放入PBS 收稿日期:2006—04—10 作者简介:张晓燕(1980一).女,硕士,从事预防兽医学研究, E—mail:weii一0@163.com 通讯作者:刘群,电话:010—62734496,E—mail:qunliu@cau.edu.cn 中37?振荡孵育20min.用不含透明质酸酶的 SAC溶液冲洗肠道内容物,100目筛过滤后,800g 离心5min,收集沉淀即为配子体. 1.2.2引物设计将GenBank中发表的GAM56 基因序列使用ANTHEWIN软件分析GAM56蛋 白的全部氨基酸序列,筛选出抗原性较强的区域,用 引物设计软件PrimerPremier5.0设计了1对特异 性引物,引物两端分别加上BarnHI和EcoRI酶 切位点.上游引物为5rl_TAGGATCCCAGG TTCACCCTTACAGCG一3,下游引物为5,_ CAGAATTCGTTGCCAAAGAGCGGAGAC一 3,引物由北京奥科生物技术公司合成. 1.2.3总RNA的提取E.maxima配子体总 RNA的提取按照Trizol试剂使用说明进行. 1.2.4RT—PCR反应反转录反应按常规方法进 行.PCR反应条件为:94?10min,94?45S,63? 45S,72?90S,30个循环,最后72?延伸10min. 反应结束后取5LPCR产物于l琼脂糖凝胶中 电泳,观察结果.按PCR产物纯化试剂盒说明回收 PCR产物. 1.2.5重组质粒的克隆和鉴定将回收后的PCR 产物和pGEM—TEasy载体按照pGEM—TEasy载 体试剂盒说明进行连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞进行蓝白斑筛选.选取白斑提取 质粒,用PCR和双酶切鉴定,阳性的重组克隆 PGEM_GAM56送至上海生工生物工程公司测序. 将测序正确的pGEM-T-56质粒以及pGEX-6p-1表 达载体用&0R工,BamHI双酶切,然后用T4DNA连 接酶进行连接,连接产物转化进E.coliBL21感受态 细胞.用PCR和质粒酶切鉴定阳性菌落. 1.2.6融合蛋白的表达将经过PCR和双酶切鉴 定的阳性菌接种于3mL含Amp(终浓度为100 mg/mL)的LB培养基中,共接种5管,37?振荡培 养至OD值约为0.4,0.6时,除第一管外,每管菌 中加入IPTG(终浓度为1.5mM)进行诱导,分别诱 导2h,4h,6h,8h.收集菌体进行SDS-PAGE检 测融合蛋白的表达.另外将BL21空菌和转入 pGEX一6p一1空载体的菌液作为对照. 1.2.7Westernblot检测将融合蛋白经SDS- PAGE电泳后,电转印至硝酸纤维素膜上,用抗 中国兽医杂志2007年(第43卷)第11期15.56.将序列和Belli等2002 年发 表的GAM56相比,同源性为99.9,只有一个碱 基发生突变(下划线标注),且氨基酸序列未改变. 所测序列如下.图2PCR产物琼脂糖电泳结果 l:扩增出的896bpGAM56基因片段;M:DL2000Marker CAGGTTCACCCTTACAGCGAGATGAGTACCTACCAGGAGGGGAGTGCCCCGGGGGCTCCGGAGGACACCACCACCA CCACTACGTCGTCCCCTGTTTCCGATGGAGCCGAGCAGTGGCTTGAGAGCTTTGTTCGTGCTGTGCAGCGCCAGCTG CAGCTTCAGGACCAAATGATGCGTCAGCTCATGAGGGACATTCAGGAGTACCTGAGCACTGCGTTCAACTGGGCAGA GAACCAGTCTACTGCCTACACCCGTGCTACCGAGATGATGGACATGATCTCCAACAGAATGAACGCTGCCATGGACAC TCAAACGAACTCATGACCACTAGCGACACCACAGACCCCGAGACCCTCCGCCGTGCAACTCGCAAGTACATGAAGG AGGTTCGCGTTCAGGACGTCCTGGTAGATGCTCTCTGGGCCTCTCTCCGCGGTGTACAGACAGCTGCCTGGATGAATG GAGTGACCGCTATTGAGAAGGAGGAGACGACTCCCATGGCTA GCCGCGCTGCTGAGGAGTTCCTCCACCGCATGTAC CATAACCTGAGGGCAGCAGGTATGTCTGAAGAAGATGTTGCCAAGTTCATCCCTAGAGCCGAGTACAACCCCTCCGA GCAGTCAAGAAATATGGGCAGAAAGGGCAGGAGCTTCTACTACGGCGGCTATCCCAGCTACTACAACTCCCCCTACTA CAGCTACAGCAGCTACCCCAGCTACTACAACTACAGCTACCCGTCATACAGCTACAGCAGCTACCCCAGCTACTACCG CTACAGCAGCTACCCCTACTACAACTACAGCTATCCCAGCTACTACAACTACGGCAGCTACCCCTACTACAGTTATAGC AGCTACCCCAGCTGGTACTGGCGCCGTCTCCGCTCTTTGGCAAC 2.4融合蛋白的表达用SDSPAGE检测发现 PCR鉴定阳性的重组子可表达相对分子量约为60.9 kDa的融合蛋白,表达量约为20%,而对照菌没有 表达此种蛋白,见图3. 2.5Westerl’lblot鉴定融合蛋白经过SDS— PAGE电泳之后,转印到硝酸纤维素膜上进行免疫 学反应,结果显示融合蛋白可被抗GST单克隆抗体 识别,表达产物具有反应原性,见图4. 3讨论 已有的研究表明,多数种球虫无性生殖阶段的 免疫原性比有性生殖阶段强E6-7~,因而目前针对球 虫疫苗功能抗原的研究大多集中在入侵阶段虫体的 相关抗原上,包括子孢子,裂殖子表面蛋白以及一些 细胞器抗原.但有性生殖阶段作为球虫生活史的重 要组成部分,无疑也发挥着重要的作用.Wallach等 在巨型艾美耳球虫的配子体上发现了3种具有免疫 14中国兽医杂志2007年(第43卷)第11期ChineseJournalofVeterinaryMedicine 2345M6 图3SDS-PAGE检测融合蛋白的表达 1:阳性菌未诱导对照组;2,5:阳性菌诱导2h,4h,6h,8h组; M:低分子量标准蛋白Marker,从上至下大小依次为97.4kDa,66.2 kDa,43kDa,31kDa,20.1kDa,14.4kDa;6:转入PGEX一61>-1空载 体菌对照组;7:阴性菌对照组 974kDa 662kDa 430kDa 3l0kDa 图4融合蛋白的WesternBlot检测结果 1:阴性对照;2:GST—GAM56融合蛋白; 3:小分子量标准蛋白Marker 原性的抗原,分别是230kDa,82kDa和56kDa蛋 白_8j.Fried等克隆出230kDa配子体抗原基因 pEM230,经过研究,它所表达的蛋白位于配子体成 壁体上,在卵囊壁形成过程中起重要作用l_9.Belli 等分析亲和纯化配子体抗原(APGA)中56kDa和 82kDa蛋白的一级结构,通过RACE法得到两种蛋 白的基因序列,其后Belli等又用原核表达载体 pTRCHisB进行重组蛋白的表达,经免疫印迹及竞 争ELISA法确定两种抗原具有免疫原性_1,经过 研究,这两种蛋白也位于配子体成壁体上,在卵囊壁 形成过程中起重要作用0.目前这3种蛋白已被 从配子体中纯化出来,组成亚单位疫苗CoxAbic,具 有不错的效果. 在抗球虫免疫中体液免疫和细胞免疫都发挥了 重要作用,一般认为后者起主要作用,主要因为T 细胞缺失的宿主不能产生针对球虫的免疫反应,而 法氏囊切除的动物仍可产生免疫反应一.但对巨 型艾美耳球虫而言,体液免疫产生的抗体能够通过 卵黄传递给子代,使子代在至少l周内具有完全的 保护性免疫.这种免疫随时间会逐渐减弱,但依然 可以持续3,6周.巨型艾美耳球虫配子体抗原与 母源免疫有着很大的相关性,而且配子体抗原是一 种比较保守的种属抗原,以此作为候选疫苗可以有 效解决抗原变异的问题. 多数研究报道显示,球虫种问的免疫交叉保护 性低.但Smith等发现E.maxima产生的母源抗 体也可以使雏鸡产生针对E.tenalla的抵抗力_5]. 因此GAM56基因作为候选疫苗的抗原基因,受到 很大的关注,本研究中利用基因重组技术,克隆出巨 型艾美耳球虫配子体抗原GAM56基因片段,表达 出GST—GAM56融合蛋白,解决了亚单位疫苗提取 蛋白的困难,为大量生产重组疫苗奠定了一定基础. 参考文献: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1o [11 [12] RoseME,LongPl.ImmunitytofourspeciesofEimeriain fowls[J].Immunology,1962,5:79-92. 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