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植物基因组DNA的提取.doc

植物基因组DNA的提取

恋上你的无赖_
2018-01-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《植物基因组DNA的提取doc》,可适用于高等教育领域

植物基因组DNA的提取植物基因组DNA的提取及其定性定量分析【实验目的】通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂可溶解细胞膜在高离子强度下(大于MNaCl)与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷因此在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快迁移距离远由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同但构型不同的DNA分子超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快其次为线状DNA(LDNA)最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键在nm波长处有特异的紫外吸收峰其吸收强度与核酸的浓度成正比这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。OD相当于dsDNAμgmlssDNAμgml和ssRNAμgml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度还可通过测定nm和nm的紫外线吸收值的比值(AA)估计核酸的纯度若DNA的AA比值高于则可能有RNA污染低于则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(、、μl量程各一支)、ml或ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、mlEP管、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、试剂×CTABbuffer乙醇RNaseA×TBE缓冲液(工作浓度)凝胶加样缓冲液(×)核酸染料DNAmarker酚氯仿(:,VV)【实验步骤】取约mg新鲜的拟南芥嫩叶放入mlEP管在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。(在液氮中先取出研磨棒和离心管离心管要迅速打开防止温度升高而弹开。研磨时要先把样品一次推到底部然后快速研磨研磨过程中要不断用液氮冷冻防止样品融化)加入ml×CTAB提取液(用前加入,的巯基乙醇)混匀颠倒几次可Vortex。水浴min每min颠倒混匀一次。(加巯基乙醇时要在通风厨进行)取出离心管冷却后加入ml酚氯仿混合液混匀充分悬浮需要Vortex。(吸取酚氯仿混合液时要吸取下层液体上层为trisHCl),rpm室温离心min(若没离好可重复一次)。将上清液(约μl)转移到另一新的ml离心管中加入与上清等体积的氯仿需要Vortex,rpm离心min。取上清约μl加入μl无水乙醇上下颠倒混匀放置min。,rpm离心min弃上清。ml,乙醇(预冷)洗涤沉淀上下颠倒几次不能Vortex,rpm离心min弃上清。再次用ml,乙醇(预冷)洗涤沉淀上下颠倒几次不能Vortex,rpm离心min弃上清。乙醇充分挥发后加入μl无菌水(含μgmlRNaseA)水浴min溶解DNA。取μlDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。

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