[doc格式] 解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和TIMP1蛋白的原位杂交检测

[doc格式] 解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和TIMP1蛋白的原位杂交检测 解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和 TIMP1蛋白的原位杂交检测 朱剑文等解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和TIMP1蛋白的原位杂交检测第l4期?1997? ? 实验与基础研究? 解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和TIMP蛋白的原位杂交检测? 朱剑文邹丽王轶英何明陈莉娟 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科(湖北武汉)430022 中国图 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 分类号R3753文献标识码A文苹编号10014411【2008)14’1997-03 【摘要】目的:探讨解脲支原体感染对早孕绒毛表达MMP9和TIMP.蛋白的影响.方法:收集生殖道解脲支原体感染 女性患者的早孕绒毛组织采用原位杂交法从RNA水平检测其MMP9和TIMP.的表达.结果:正常妊娠时MMP和TIMP.蛋白在 早孕绒毛中呈强阳性表达,而胚胎绒毛组织解脲支原体感染者其早孕绒毛中MMP9和TIMP.蛋白表达减弱,差异有显着性(P< 0.05),其MMP9/TIMP比值显着小于正常妊娠时的比值,两者比较差异有显着性(P<0.05).结论:解脲支原体感染状态下能 对早孕绒毛中MMP9和TIMP蛋白表达造成影响,使其MMP9/TIMP. 比值显着降低,从而对早孕绒毛滋养细胞侵蚀力造成影响. 【关键词】解脲支原体滋养细胞基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶抑 制物 InfectionofUreplasmurealytium(Uu)ontheexpression0fM9andTPlin thevillustissueduringearlypregnantstage ZHUJian—Wen,ZOULi,WANGYi—Ying,eta1.DepartmentofObstetrics andGynecology,UnionHospital,To.all MedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,Hubei,China (Abstract]Objective:ToinvestigatetheimpactofinfectionofUreplasmttrealy’tium(Uu)ontheexpressionofMMP9andTIMP1 inthevillustissueduringearlypregnantstage.Methods:ThevillustissuesofthepregnanciesWerecollectedduringtheirearlypregnantstage (28casesofasymptomaticinfectionofUu)forinsituhybridizationtoexaminetheexpressionofMMP9andTIMP1.Restdts:MMP9/TIMP1 werestronglyexpressedinthevillusofnormalpregnancywhilethosewereweakerinthevillusofasymptomaticinfectionofUu(P<0.05). TheratiosofMMP9/TIMP1werealsodecreased(P<0.05)betweenthenormalpregnancyandtheasymptomaticinfectionof Uu.Conclusion:InfectionofUuhavemarkedlyeffectontheexpressionofMMP9andTIMP1introphoblastsofpregnanciesduringtheirearly gestation,itCandecreasetheratioofMMP9/TIMP1andaffecttheinvasivefu nction. [Keywords]Ureplasmurealyti啪;Trophoblast;MMPs;TIMPs 解脲支原体(Ureplasmure由CUlTI,Uu)是常见的性传播 疾病的病原体,可侵入女性生殖系统引起无症状性的泌尿系 感染,因此引起了国内外学者的广泛关注…,并能造成部分 患者输卵管妊娠和不孕.3】.为了解女性下生殖道uu感染对 早孕绒毛滋养细胞表达MMP9和TIMP的影响,我们采用原 位杂交法从RNA水平对其进行检测,现将结果报道如下. 1资料与方法 1.1研究资料选择2003年7月,2005年5月问在我院门 诊要求行人工流产之早期妊娠者94例作为研究对象,年龄 20,33岁,平均27.2岁,均无生殖道畸形及急性泌尿生殖道 炎症,亦无内分泌异常和其他内科疾病.所有对象先进行宫 颈分泌物的uu检测,阳性者继续收集胚胎组织标本,阴性者 随机抽取5例作为阴性对照. 1.2标本采集宫颈分泌物的采集:采用特制无菌棉拭采集 宫颈分泌物,置于盛有1.5ral无菌生理盐水的塑料离心管中, 充分将棉拭上的分泌物洗下,贴管壁将棉拭挤干弃去.然后 每份标本均分两管,以15000rpm/min离心10min,弃上清, ?基金项目:湖北省自然科学基金资助(项目编号:2001ABB131) 在沉淀中加50DNA提取液充分混匀沉淀物,煮沸10min, 10000rpm/min离心5rain取上清,制备成模板DNA备用; 胚胎组织采集:?按无菌程序操作获取部分胚胎组织,剥除 表面部分,挑取核心组织,置于生理盐水中,一20冷冻待 检.取2nun3组织块,剪碎,采用裂解液加蛋白酶K消化法, 制备成模板DNA备用,余组织进行下一步.?标本离体后1 份迅速(30min内)置于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中 固定约6h.梯度酒精脱水,每浓度下约1.5h.透明,浸蜡, 包埋,常规切片(厚5,6vLm). 1.3方法QUu检测:采用中山医科大学达安基因股份有 限公司提供的PCR试剂盒.扩增条件为94加热2min,然 后按9345s,55?45s,7260s共35个循环,最后 72保温2min.自动PCR仪为德国Eppendorf公司产品,电 泳仪为北京六一仪器厂的DYY一3型,紫外透射分析仪为华 美公司uV一200型.扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后用透 射分析仪检测,uu在459bp处出现阳性带,并与阳性对照一 致即为阳性.(~)MMP9和TIMPmRNA检测:采用武汉博士德 生物工程有限公司提供的MMP9和TIMP原位杂交试剂盒. 石蜡切片常规脱蜡至水.3%过氧化氢室温下处理10min,蒸 馏水洗涤两次.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬 ? 1998? 酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白 酶,混匀),37?消化4JDmin,0.5MPS洗3次×5rain,蒸馏 水洗涤1次.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油2o血以保持湿度.按每张切片20加预杂交液, 恒温箱37?4h,吸取多余液体,不洗.杂交:每张切片加 20杂交液(分别含MMP9或TIMP,寡核苷酸探针),将原 位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上,恒温箱 40?杂交过夜.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,30,37左右水 温的2×SSC洗涤5min×2次;0.5XSSC洗涤1minX1次, 0.2×SSC洗涤15min×1次(如果有非特异性染色,重复 0.2×SSC洗涤15min×1,2次).滴加封闭液:37?30min. 滴加生物素化鼠抗地高辛:37?60min.0.5MPBS洗5min× 4次.滴加SABC:37?20min.0.5MPBS洗5min×3次. 滴加生物素化过氧化物酶:37?20min,5rain×4次.DAB 显色:使用DAB显色试剂盒lml蒸馏水加显色剂A,B,c各 1滴,混匀,加至标本上,充分水洗.苏木素复染,充分水 洗.酒精脱水,二甲苯透明,封片.?图像分析:阳性细胞 为镜下组织细胞结构清晰,细胞浆内有棕黄色颗粒沉着.采 用HPIA一1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济千屏影 像工程公司设计)处理.每张切片(放大200倍后)随机取 1O个不重叠的视野,分别测得每视野阳性表达的平均光密度, (MMP9和TIMP具有相同的调零基点,有关测量参数设置相 同)计算每张片的平均值,从而得出每例的平均值. 图1iMP9mRNA在正常早孕绒毛 滋养细胞中呈强阳性表达(原位杂交:<200) 图3绒毛Uu感染患者的早孕绒毛组织中 MMP9呈阳性表达(原位杂交~200) 中国妇幼保健2008年第23卷 1.4统计学处理所得数据输入计算机,应用SPSS10.0统 计软件处理.所有数据用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差表示,各组间差异检 验采用方差分析. 2结果 2.1宫颈分泌物Uu阳性患者其早孕绒毛组织中Uu分析结 果94例要求人工流产的妇女中有28例宫颈分泌物中检测出 Uu感染,检出率为29.8%,进一步的检测发现,28例Uu感 染患者的早孕绒毛组织中Uu阳性者13例,其宫颈分泌物和 早孕绒毛组织中Uu检测符合率为46.4%. 2.2uu感染患者早孕绒毛组织中MMPq和TIMPmRNA的表 达MMP9mRNA在正常早孕绒毛问质,血管,滋养细胞,蜕 膜组织中呈强阳性表达,TIMPmRNA在滋养细胞,绒毛血管 壁,蜕膜组织中亦呈强阳性表达.28例Uu感染患者中13例 绒毛uu阳性者,其早孕绒毛组织中MMP9,TIMP,mRNA的 表达逐渐减弱,绒毛间质血管壁,蜕膜组织中MMP9mRNA, TIMPmRNA均呈阳性表达(图1一图4).与正常早孕绒毛相 比,其表达的差异均有显着性(P<0.05).且其 MMP9/TIMP比值显着小于正常早孕的比值,差异有显着性 (P<0.05).而余15例绒毛未感染Uu者,其早孕绒毛组织中 MMP9,TIMPmRNA亦呈强阳性表达,与正常早孕绒毛相比, 其表达的差异无显着性(P>0.05).见附表. 图2lIMPlmRNA在正常早孕绒毛 滋养细胞,绒毛血管壁中呈强阳性表达【原位杂交:<200) 图4舢lInRNA在绒毛Uu感染患者 之早孕绒毛滋养细胞,绒毛问质,血管壁 中呈阳性表达(原位杂交X200) 朱剑文等解脲支原体感染患者早孕绒毛MMP9和TIMPl蛋白的原位杂交检测第14期?1999? 附表MM1.9和TIMP1mRNA在正常早孕绒毛和绒毛Uu感染者以及绒毛未感染uu者早孕绒毛组织中的表达(?) ?表示分别与对照组比较差异无显着性(P>0.05);?表示分别与对照组比较差异有显着性(P<0.05) 3讨论 3.1Uu感染与生殖道炎症Uu是介于细菌和病毒之间的病 原微生物,是引起女性生殖器官感染的常见病原体.uu寄生 于呼吸道和泌尿生殖道黏膜表层,含有DNA,能在女性生殖 道引起感染导致宫颈炎,急性子宫内膜炎,急性输卵管炎等. 但多数病人在感染Uu后,临床上多呈现出非特异性的表现, 相当部分患者为无症状的携带状态.其宫内感染可造成受精 卵着床障碍,绒毛受损,最终导致妊娠终止.其机制可能与 Uu产生的磷酯酶A,c促使细胞膜中游离的花生四烯酸释放, 而花生四烯酸是前列腺索的必需前体物质,能损伤胚胎组织 及其附属物而影响妊娠结局】.实验证实Uu产生的高分子质 量物质能刺激宿主免疫活性细胞产生,释放多种细胞因子而 造成早孕蜕膜的局部免疫损伤】,这些都可以改变滋养细胞 的侵蚀力从而导致流产,胚胎停育等病理妊娠的发生.我们 在研究中发现,94例要求人工流产的妇女中有28例宫颈分泌 物中检测出Uu感染,检出率为29.8%,进一步的检测发现, 有13例患者的早孕绒毛组织中检测出Uu感染.这进一步证 实了即使是无症状Uu感染仍有可能在一定时间内上行至子宫 腔,造成子宫内膜感染,而后造成胚胎受累及. 3.2MMP9及TIMP,与正常妊娠在孕卵着床和胎盘形成过 程中MMP2,9发挥主要作用,并受TIMPs的调节,其作用受到 滋养层因索介导的自分泌途径和子宫因索介导的旁分泌途径 的严格调控】0妊娠早期正常胎盘形成和妊娠子宫一胎儿血 管系统的建立有赖于滋养层细胞向母体血管内侵入.有报道 指出,滋养层细胞侵入血管后沉积于血管壁中,在绒毛和蜕 膜血管壁中MMP9及TIMP,mRNA强阳性表达,说明滋养层细 胞通过这些分子协同作用促使螺旋动脉部分转化为子宫胎盘 动脉.滋养层细胞于孕10周左右沿螺旋小动脉逆行浸润,孕 12周达蜕膜段,孕20周可达子宫肌层1/3深度盯】.妊娠早中 期滋养层细胞表达MMP9及TIMP,mRNA最强,表明在这些特 定区域的协同表达共同完成对细胞外基质的降解,有利于胎 盘形成. 3.3uu感染对早孕绒毛表达MMP9和TIMP,蛋白的影 响uu具有极强的吸附能力,既可以寄生于女性上下生殖道, 也可以吸附在精子表面进入女性体内,引起蜕膜发生炎性反 应和炎性细胞浸润,以巨噬细胞及中性粒细胞等炎症细胞为 主,被激活的巨噬细胞可产生大量的TNF—Or-,干扰索和 IL一6,IL一1及IL一2等】,从而影响早孕绒毛滋养细胞的侵 蚀力,继而影响胎儿的正常生长,同时还可以刺激巨噬细胞 和羊膜细胞产生前列腺索类物质,干扰凝血系统,引起胎盘 血栓,损坏蜕膜血管等.本研究发现,13例绒毛uu感染患者 的早孕绒毛组织中MMP9,TIMP,mRNA的表达逐渐减弱,绒 毛间质血管壁,蜕膜组织中MMP9mRNA呈阳性表达, TIMP,mRNA亦呈阳性表达,与正常早孕绒毛相比,其表达的 差异有显着性(P<0.05).且MMP9/TIMP,比值显着小于正 常早孕的比值,差异有显着性(P<0.05).其结果有力证实 了uu感染状况下早孕绒毛组织中MMP9/TIMP比值显着降 低,直接影响到滋养细胞对子宫蜕膜层的侵蚀,因此推测Uu 感染导致的早孕绒毛滋养细胞侵蚀力的下降可能与流产,胚 胎停育等病理妊娠密切相关. 综上所述,Uu是母婴感染的重要病原体,其无症状的携 带状态也应引起临床工作者的高度重视,因其可造成绒毛滋 养细胞侵蚀力下降,因此可能在流产,胚胎停育等病理妊娠 的发生过程中起着重要作用. 4参考文献 1丁爱军.围生期解脲支原体感染.国外医学儿科学分册,1998, 25(1):23 2朱剑文,李敏,邹丽.无症状沙眼衣原体和解脲支原体感染 与输卵管妊娠的关系.中国误诊学杂志,2002,2(8):1125 3朱剑文,邹丽,陈莉娟.无症状沙眼衣原体和溶脲脲原体感染 与输卵管不孕症的相关性研究.现代医学,2005,33(1):25 4Taylor—RobinsonD,FurrPM.Obsorvafionsonexperimentalcolonisation ofmicebyureaplasmasofhumangimJMedMicrobiol,2002,51: 866 5王敬云,刘杰.支原体感染与妊娠.中国实用妇科与产科杂志, 2001,17(12):713 6XuP.Expressionofmatrixmetalloproteinase(MMP)-2andMMP-9 inhumanplacentaandfetalmembranesinidationtopretennandterm labor.JclinEndocrinolMetab,2002,87(3):1353 7WidsehevenelterM.pre—eclampsia:adisorderofplacentalmitochom— dria?MolmodToday,1998,(7):286 8JanJ.Themyometrialjunefionalgonespiralarteriesinnormalandabnor- realpregnancies.AmJObstetGynecol,2002,187:1416 (2007-04-03收稿) [编校刘鹏博]