低频脑深部电刺激对大鼠杏仁核点燃的抑制作用及其相关机制探讨

低频脑深部电刺激对大鼠杏仁核点燃的抑制作用及其相关机制探讨 低频脑深部电刺激对大鼠杏仁核点燃的抑 制作用及其相关机制探讨 ? 296?中华物理医学与康复盘查!生旦篁!鲞整塑!旦!!z!:!!!!: 低频脑深部电刺激对大鼠杏仁核点燃的 抑制作用及其相关机制探讨 王乃东赵永波陈英辉呙登俊张芳岳旺 . 基础研究. 【摘要】目的采用大鼠杏仁核点燃模型研究低频脑深部电刺激的抗癫痫作用及其相关机制.方 法首先建立大鼠杏仁核电刺激点燃模型,观察低频脑深部电刺激对其点燃发作的抑制作用,并通过联合应 用抗癫痫药物(如丙戊酸钠,尼卡地平等)观察其协同功效.结果低频电刺激(持续刺激15min,频率为 1Hz,波宽为0.1ms,强度为100—350A)能够有效抑制大鼠杏仁核点燃发作(P<0.05);将对杏仁核点燃 无明显影响的低能量低频电刺激与低剂量丙戊酸钠或尼卡地平联合应用,发现在抑制杏仁核点燃发作方面 具有协同效应,能显着抑制杏仁核点燃发作(P<0.05).结论低频脑深部电刺激能有效抑制大鼠杏仁核点 燃发作,与丙戊酸钠或尼卡地平联用具有协同功效. 【关键词l低频电刺激;杏仁核点燃;癫痫;大鼠 Theinhibitiveeffectoflowfrequencyelectricbrainstimulationonamygdalekindlinginratsa nditspossible mechanismsWANGNai—dong,ZHAOYong—bo,CHENYing?hui,GUODeng-jun,ZHANGFang,YUEWang.E— mergencyDepartment,theAffiliatedHospitalofQingdaoMedicalCollege,Qingdao266003,China 【Abstract】 objectiveToinvestigatetheeffectoflowfrequencyelectricdeepbrainstimulationonamygdale kindlinginrats.MethodsTheamygdIalekinklingmodelofratswasestablishedbyoperationonthebrain.The effectsoflowfrequencydeepbrainelectricstimulationusedaloneorincombinationwithanti?-epilepsydrugswereob?? servedintermsofseverityofseizureattackreflectedbyRacine'Sscaleandafterdischargedurationrecordedinelectro— eneephalogram.ResultsFifteenminutesoflowfrequencyelectricstimulationat1Hzand100to350IxAeffective— lyinhibitedamygdalekindlingasdemonstratedbyasignificantdecreaseofafterdischargeduration,anddecreasedthe severityofseizureattack(P<0.05).Thecombinationoflowfrequencystimulationwithvalproatesodiumorincardip? ineshowedsynergiceffect.ConclusionLowfrequencydeepbrainstimulationcansignificantlyinhibitamygdala kindlinginrats,andhassynergiceffectswithvalproatesodiumandnicardpine. 【Keywords】Lowfrequencystimulation;Amygdalakindling;Epilepsy;Rat 人们尝试将脑深部电刺激(deepbrainstimulation, DBS)用于治疗癫痫已有较长历史,早在1978年就有 学者报道,于硬膜下刺激小脑可减少癫痫患者的发作 频率,但后来由于种种原因该研究一度被中断.80年 代后期及90年代随着DBS在治疗运动障碍性疾病和 慢性疼痛领域中的广泛应用,其在癫痫治疗尤其是难 治性癫痫干预方面的作用再度受到人们重视,但是最 佳的刺激模式,频率,强度,靶位,适应证以及电刺激治 疗确切机制等目前还不十分清楚.本研究利用与 人类复杂部分性癫痫相似的慢性大鼠杏仁核电点燃模 型,观察局灶性应用DBS的抗癫痫作用,同时对其抗 癫痫机制进行探讨.现将结果报道如下. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370511);上海市卫生局 青年基金资助项目(034Y04) 作者单位:266003青岛,青岛大学医学院附属医院急诊神经内科 (王乃东);上海交通大学附属第一人民医院(赵永波,陈英辉,呙登俊); 青岛大学医学院药理教研室(张芳,岳旺) 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 一 ,实验动物与设备 本研究共选取健康雄性Wistar大鼠150只.体重 200,250g,由上海市第一人民医院动物实验中心提 供.实验开始前,将大鼠置于实验室内适应性喂养1 周(单笼饲养),保持饲养室内安静,温度稳定在(204- 2)?,相对湿度为60%,光照时间为12h/d,清洁饮 水, 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 饲养.主要实验设备包括脑立体定向仪(江 湾I型,由第二军医大学生产)和Powerlab信号 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 系 统;电子刺激器(SEN一3201型)和刺激隔离器(SS一102J 型,日本光电公司产). 二,大鼠杏仁核电点燃模型制备及实验操作 1.大鼠杏仁核电点燃模型制备:采用戊巴比妥钠 按40mg/kg体重腹腔注射麻醉大鼠,待麻醉剂生效后 将大鼠固定于脑立体定向仪上,参照Konig图谱确定 大鼠右侧杏仁核位置…,于大鼠前囟后3.0mm,右侧 旁开4.8mm,颅骨表面下8.8mm处插入双极绝缘镍 中华物理医学与康复杂志!生旦釜!鲞笠塑!!!:!!!!!:!: 铬电极(直径0.16mm),电极另一端分别焊接微型插 头,然后将电极,微型插头等用牙科水泥固定于颅骨表 面,术后大鼠每日腹腔注射青霉素10万U,连用3d 以预防感染.实验大鼠于手术结束7d后给予电刺 激,点燃电刺激参数为60Hz,矩形方波,波宽1ms,强 度100,400IxA,持续时间1s,每日电刺激1次;低频 电刺激(1ow—frequencystimulation,LFS)参数为1Hz,矩 形方波,波宽0.1ms,强度100,400IxA,每次持续作 用15min,每日1次.点燃及LFS均由同一刺激器产 生,通过同一对电极输出.当电刺激开始后,采用 Powerlab信号记录系统记录,分析大鼠脑电活动,将后 放电时程(afterdischargeduration,ADD)及行为发作强 度作为本研究重点观察指标,其中ADD指电刺激后大 鼠杏仁核脑电波幅至少为刺激前2倍且频率在1Hz以 上的放电持续时间;行为发作强度则根据Racine分级 法划分为5级,I级表示大鼠闭眼,胡须抖动,嗅,面 部抽搐;II级表示大鼠点头,咀嚼伴面部抽搐;III级表 示大鼠一侧前肢抬起阵挛;IV级表示大鼠站立伴两侧 前肢阵挛;V级表示大鼠站立跌倒伴全身痉挛,其中 IV,V级发作可作为继发性全身性癫痫模型制作成功 的判定标准,若实验大鼠连续出现3次V级发作反应 即视为完全点燃. 2.LFS对大鼠杏仁核点燃发作的影响:取实验大鼠 32只,按照上述方法每日给予1次单纯点燃电刺激,直 至实验大鼠完全点燃.将完全点燃的实验大鼠随机分 为4组,每组各8只.于每次点燃电刺激前,先给予 LFS15min,每日1次,共刺激20次,各组大鼠的LFS强 度分别是50,100,250及350la,A,记录各组大鼠ADD数 据及发作分级,与实验前数据进行自身对照. 3.LFS和丙戊酸钠联用对大鼠杏仁核点燃的影 响:取实验大鼠24只,按照上述点燃方法每日给予1 次单纯点燃电刺激,直至实验大鼠完全点燃.将完全 点燃的实验大鼠随机分为3组,每组各8只.第1,2 组大鼠分别按200,500mg/kg体重给予丙戊酸钠,记 录给药前,后ADD数据和发作分级并进行自身对照; 另一组则选择对ADD及癫痫发作分级均无明显影响 的相应剂量丙戊酸钠与强度为50A的低频电联合 作用点燃大鼠.记录干预前,后大鼠点燃发作的ADD 数据及发作分级并进行自身对照. 4.LFS和尼卡地平联用对大鼠杏仁核点燃的影 响:选取实验大鼠24只,按照上述点燃方法每日给予 1次单纯点燃电刺激,直至实验大鼠完全点燃;再将点 燃大鼠随机分为3组,每组各8只,联合应用对点燃无 明显影响的低剂量尼卡地平2mg/kg体重和强度为 50A的低能量LFS作用实验大鼠,记录干预前,后大 鼠ADD数据及发作分级并进行自身对照. ? 297? 5.LFS对大鼠点燃过程的影响:取实验大鼠40 只,将其随机分为5组,每组各8只.每组大鼠分别于 点燃电刺激前,分别给予强度为0,50,100,250, 350A的LFS,持续时间为15min,每日1次,共刺激 20次,记录大鼠的ADD数据及发作分级.将上述所 得数据与单纯点燃电刺激组大鼠进行比较. 各组实验大鼠于实验结束后采用灌注盐水及4% 多聚甲醛方式将其处死,经断头取脑并将脑组织于 4%多聚甲醛内固定24h后行冠状切片(片厚 50m),经HE染色后置于光镜下观察电极位置. 三,统计学分析 本研究所得数据以(?s)表示,采用配对t检验 对大鼠干预前,后各项指标进行分析,P<0.05表示差 异具有统计学意义. 结果 各组实验大鼠脑组织标本经光镜观察后发现,其 电极均埋藏在杏仁核中央及基底外侧部.单纯电点燃 组大鼠随电刺激次数增加,其行为由开始时的局部异 常向全身性阵挛,惊厥过渡,该组大鼠经平均刺激(18 ?3.0)次出现点燃发作的RacineV级反应. 一 ,LFS对大鼠杏仁核电点燃发作的影响 通过预先给予完全电点燃大鼠强度分别为350, 250,100及50A的LFS,发现能够缩短点燃电刺激 引发的ADD(P<0.05),降低Racine分级(P<0.05), 抑制杏仁核点燃发作;其中实验大鼠经强度为350A 电刺激后,其癫痫发作从未达到V级,但是部分大鼠 经该强度电刺激时出现烦躁表现,而强度为50A的 LFS对大鼠杏仁核电点燃发作无显着影响(P> 0.05),具体结果详见表1. 表1LFS对大鼠杏仁核电点燃发作的 影响(牙?s) 注:与刺激前比较,P<0.05 二,LFS与丙戊酸钠联用对大鼠杏仁核电点燃发 作的影响 与给药前比较,单纯给予丙戊酸钠500mg/kg体 重能缩短电点燃大鼠的ADD,降低其Racine分级 (P<0.05),而200mg/kg体重的丙戊酸钠剂量对杏 仁核电点燃无明显影响,具体数据详见表2.将对点 燃无明显影响的低剂量丙戊酸钠(200mg/kg体重)与 强度为50A的LFS联合作用实验大鼠,发现能够显 ? 298?中华物理医学与康复盘查21笙箜!鲞筮塑!堕!!!!!!!!!: 着缩短电点燃大鼠的ADD,降低Racine分级(P< 0.05),具体数据详见表2. 表2丙戊酸钠及LFS联合应用对 s) 大鼠杏仁核电点燃发作的影响(元? 注:LFS+丙戊酸钠联合干预的剂量分别为5OA和200mg/kg体 重;与刺激前比较,P<0.05 三,LFS及尼卡地平联用对大鼠杏仁核电点燃发 作的影响 将强度为50A对大鼠杏仁核电点燃无显着影 响的LFS与同样对杏仁核电点燃无显着影响的低剂 量尼卡地平(2mg/kg体重)联合作用实验大鼠,发现 能显着缩短电点燃大鼠的ADD,降低其Racine分级, 对大鼠杏仁核电点燃发作具有明显抑制效应,具体数 据详见表3. 表3LFS与尼卡地平联用对大鼠杏仁核电点燃 发作的影响(i4-s) 注:LFS的强度为50A,尼卡地平的剂量为2ms/kg体重;与刺激 前比较,P<0.05 四,LFS对大鼠杏仁核电点燃进程的影响 在实验大鼠杏仁核电点燃过程中,于点燃刺激前, 预先给予强度分别为250,350A电刺激后,发现只有1 只大鼠出现了V级发作,其它大鼠均没有达到点燃状 态;如预先给予实验大鼠强度分别为50,100A的电刺 激后,发现大鼠需要更多的点燃次数才能达到杏仁核点 燃发作;如预先给予大鼠强度为100,350A的电刺激 (其它刺激参数同上)后,发现实验大鼠ADD明显缩短, Racine分级显着降低(P<0.05),具体数据详见表4. 表4LFS对大鼠杏仁核电点燃进程的影响 (元4-s) 注:与强度为0A的LFS比较,P<0.05 讨论 大鼠杏仁核电点燃模型因可快速点燃故被科研 及临床广泛采用,它所表现出的脑电异常活动及惊 厥与人类癫痫发作较类似,是目前国际公认的研究 癫痫及寻找抗癫痫新药的理想动物模型,本研究正 是利用该模型来观察低频脑深部电刺激对癫痫发作 的抑制作用. 目前脑电刺激可作为药物治疗效果欠佳患者的 一 种替代治疗,同手术相比,电刺激治疗具有可逆性 及可调节性等优点.本研究结果提示,利用低频电 流直接电刺激大鼠杏仁核,能够有效抑制大鼠杏仁 核电点燃发作.这与既往的研究结果一致.早前研 究显示,在成年及发育中大鼠以及在颞叶中央回癫 痫患者中,LFS(0.9,3.0Hz)可对其癫痫发作产生 显着抑制效应,LFS可提高后放电和发作阈值, 即使在停止电刺激后的几周甚至几个月内仍可保持 这种抑制效应.另外本实验发现,在大鼠杏仁核 点燃进程中给予较大能量的LFS,能够有效缩短其 ADD及降低发作分级,甚至可以阻止其完全点燃,表 明LFS对实验大鼠点燃进程以及完全点燃的大鼠都 具有阻止点燃,抑制癫痫发作的功效;同时我们在实 验中还观察到有些大鼠经强度为350A的电刺激 后,会出现烦躁不安等表现,有时甚至表现为不能耐 受,提示在临床实际应用LFS过程中,须找到合适的 电刺激强度,既可有效抑制癫痫发作,又能使患者耐 受良好. 研究表明,LFS对癫痫点燃状态的抑制作用主要 是通过增加痫性发作阈值实现的,但其确切机制目 前仍不十分清楚.Benedict等比较了LFS和高频 电刺激对离体海马脑片痫性活动的影响,结果发现 持续10min的低频或高频电刺激都可以抑制癫痫活 动,其中1HzLFS的抑制作用呈渐进性,持续时问较 长;而100Hz高频电刺激的抑制作用表现较迅速,但 持续时间较短,并且1HzLFS对自发性和继发性癫痫 活动的长时程抑制(1ong-termdepression,LTD)作用 较显着,这种抑制作用可被谷氨酸,N一甲基.D一天冬氨 酸受体拈抗剂AP5所缓解.LFS时LTD的作用非常 重要,LTD可能在降低神经元兴奋性方面具有重要 作用,因为AP5可以逆转这种抑制效应.1Hz低频 电流刺激海马CA1区15min可产生峰电位(popula. tionspike,PS)或者兴奋性突触后电位(excitatory postsynapticpotentials,EPSP)的LTD,LTD和EPSP 均具有钙依赖特性,能够调节神经突触可塑性.LFS 可导致机体低钙,能激活蛋白磷酸化酶;而高频电刺 激可导致机体高钙并激活蛋白激酶?.目前研究发 中华物理医学与康复杂志2007年旦笙鲞笙塑:型:!!!: 现,任何一种激酶或磷酸化酶的活性增高,均可以改 变其相应离子通道的导电性,其相关治疗机制是通 过磷酸化和去磷酸化实现的,作用位点是谷氨酸,N一 甲基一D一天冬氨酸以及GABAA受体?.钙通道水平 的改变可能是LFS发挥抗癫痫功效的重要因素之 一 .目前已知丙戊酸钠属于GABA能增强剂,可通 过激活谷氨酸脱羧酶,提高脑内GABA含量而发挥 抗癫痫作用;同时钙离子参与抗癫痫过程的作用机 制已日益受到人们关注,既往研究发现,尼卡地平可 显着抑制大鼠杏仁核点燃发作.本研究结果显 示,低能量LFS分别与低剂量丙戊酸钠或尼卡地平 联用,可以对抑制杏仁核点燃产生协同作用,提示 LFS对大鼠杏仁核点燃的抑制作用与脑内GABA系 统及钙通道系统具有相关性,但LFS与该两种系统 间的确切关系还需进一步研究. LFS对杏仁核点燃的抑制作用还可能与改变脑 内癫痫相关受体有关.L6pez—Meraz等"研究了LFS 对杏仁核电点燃大鼠脑内几种受体的影响,发现LFS 的抗癫痫作用可能与GABA-苯二氮革受体系统及内 啡肽系统有关,而与Ot.肾上腺受体及腺苷环化酶 无关. 综上所述,本研究结果表明,LFS可有效抑制杏 仁核电点燃大鼠的点燃发作,并与GABA能系统增 强剂(如丙戊酸钠等)或钙通道阻滞剂(如尼卡地平 等)联用在控制癫痫发作方面具有协同功效,提示可 针对临床上许多难治性癫痫患者(尤其是儿童患者, 其发作多呈局灶性特点)于精确定位后给予局部电 刺激治疗,促其疗效进一步改善;但LFS抗癫痫的确 切机制目前尚未清楚,同时LFS的不良作用,尤其是 刺激部位及其远隔部位的形态学及行为学改变以及 对机体认知和记忆功能的影响等还需进一步深入 探讨. ? 299? 参考文献 WilliamHT,RobertSF.Brainstimulationforepilepsy.Lancet,2004,3: 332.335. RacineRJ.Modificationofseizureactivitybyelectricalstimulation. II.Motorseizure.ElectroencephClinNeurophysiol,l972,32:28I- 285. 岳旺,王蕾,张芳.尼卡地平对大鼠杏f二核点燃的抑制作用.中国 药理,2001,22:365—368. V~lisekL,VeliskovaJ,StantonPK.Lowfrequencystimulationofthe kindlingfocusdelaysisolateralamygdalekindlinginimmaturerats. NeurosciLett,2002,326:61-63. YaumotoJ,KedaA,SatowT,eta1.Low—frequencyelectriccorticalstimu— lationhasaninhibitoryeffectonepilepticfocusinmesialtemporallobe epilepsy.Epilepsia,2002,43:491-495. 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(修回日期:2007.03-20) (本文编辑:易浩) 国家继续医学教育项目——关于举办全国言语障碍, 吞咽困难培训班 通知 关于发布提成方案的通知关于xx通知关于成立公司筹建组的通知关于红头文件的使用公开通知关于计发全勤奖的通知 ? 消皂,? 为了满足各单位亟待培训言语障碍训练人员的需要,北京天坛医院神经内科将于2007年7月2至5日举办为期3天的言语障 碍,吞咽困难培训班.本培训由欧阳来祥(美籍华人)教授主讲,欧阳教授为美国加州嘉惠尔医院语言治疗部主任,双语语言治疗主 任医生,曾在美国UCLA医院,脑伤康复中心和怀特医院等从事语言治疗工作2O余年.讲课内容将理论与实践相结合,突出动手 操作能力的培训.本培训班为全国继续医学教育培训项目,培训结束将授予继续教育学分l0分. 学员条件:具有中专或中专以上学历,热爱语言,吞咽困难康复事业.教学目的:学习言语障碍,吞咽困难的理论与训练技术, 重在提高学员的实际训练能力.教学方法:理论教学,示范,实习,讨论相结合.收费标准:学费800元,资料费200元(包括言语障 碍,吞咽困难康复训练示范光盘),食宿由培训班同一安排,费用自理.讲课地点:北京天坛医院教学楼阶梯教室. 联系方式:北京市崇文区天坛西里6号北京天坛医院神经内科,张玉梅,张婧,周筠;邮政编码:100050;电话:010—86416847, 86879887,l38ll3l3897;E—mail:zhangyumei95@yahoo.corn.cn或zhangfengjing73@yahoo.corncn. ]]]]]]]]]]] m?