根系活力与过氧化物酶活性的测定
丁丽20050301 喻若颖20050337 彭婵娟20050339 一 实验目的
掌握α-萘胺法测定根系活力.
观察重金属胁迫对根系活力的影响.
掌握比色法测定过氧化物酶的活性的原理和步骤.
二 实验原理
植物根系能氧化α-萘胺，可通过测定溶液中未被氧化的α-萘胺含量，定量测定根系活力。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量OD470nm变化来测定其活性。
三 实验方法
1.α-萘胺法测定根系活力(萘胺氧化法)
?取50ug/mlα-萘胺和磷酸缓冲液各25ml，于三角瓶混匀，须根系洗净吸干，取1,2g浸入三角瓶，取同样α-萘胺、磷酸缓冲液各25ml于另一三角瓶，不放须根系作对照，5分钟后，两瓶各取2ml，按步骤3做第一次测定;
?将两三角瓶置于25?恒温箱避光保存60分钟后，各取2ml，按步骤3做第二次测定; ?取2ml培养液加10水混匀，再顺次加入1ml对氨基苯磺酸与1ml亚硝酸钠，混匀观察颜色变化，再定容至25ml，室温25分钟，于510nm测OD值;
?作
标准
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曲线:以50ug/mlα-萘胺为母液，配液40、30、20、10、5、0ug/ml溶液各10ml，各取2ml，按步骤3分别反应，测OD值，以OD值为纵坐标、浓度为横坐标作标准曲线，计算回归方程;
?分别查对标准曲线，或利用回归方程，计算出实验组与对照组实验前后对应的α-萘胺浓度。
2.过氧化物酶活性的测定(比色法)
?提取酶液
?现配反应混合液，即30mlpH6.0磷酸缓冲液加28ul愈创木酚加19ul双氧水(30%) ?取2只比色杯，1只加3ml反应液和0.2ml磷酸缓冲液调零。另取一只加3ml反应液和0.2ml酶液，立即计时开始测量。每隔10s读数一次，直至OD470nm?1.000 ?计算酶活性大小:过氧化物酶活性(u/g FW*min)=?A470*Vt/(W*Vs*0.01*t) 四 实验结果
1.根系活力测定(gFW.h)
α-萘胺浓度 0 5 10 20 30 OD510nm 0.094 0.213 0.431 0.595 0.825
实验组 对照组 5分钟后60分钟后 5分钟后 60分钟后
OD值 0.385 0.292 0.383 0.415 α-萘胺浓度 18.7 14.2 18.6 20.2
45
40
35
30
25
20OD510nm
15
10
5
0
123456
a-萘胺浓度(ug/mL)
根系活力测定标准曲线 2.过氧化物酶活性
时间(s)10 2030 40 50 60 70 OD值0.334 0.350 0.3640.377 0.593 0.4080.422
五 误差
分析
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1.α-萘胺法测定根系活力
由于标准曲线是由其他组做的，其误差就不在此分析了 由公式C=(C1-C2)-(C3-C4) α-萘胺
其中C1指实验组5分钟后α-萘胺浓度，
实验组60分钟后α-萘胺浓度 C2指
C3指对照组5分钟后α-萘胺浓度
C4指对照组60分钟后α-萘胺浓度
C4为负值，可能是由人为误差或机器误差引起的。 而由所得数据C3-
误差有可能是以下原因:
仪器不干净;由于当时气温比较高，所以没有在恒温箱中保存，气温的变化也可能影响结果; 实验组和对照组也存在时间差;实验是小组三人一起配合的，也存在个人的操作误差。
2.过氧化物酶活性
首先是取材问题，由于是新鲜叶片，水分不可能完全擦干净，会存在误差; 其次离心后的上清液不可能完全转移;
另外酶保藏液解冻后可能未摇匀，或在测量前加底物与反应物的试管没有摇匀 还有两只比色杯由于不一样，肯定有误差;
并且10s后计一次数，也存在时间误差;
最后也是因为个人的操作误差和仪器的误差。
浙公网安备 33021202002483