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医药学论文-益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用

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医药学论文-益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用医药学论文-益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用 作者:周重建,马迎辉,舒冰,王拥军,施杞 【关键词】 ,神经肌肉接头 [摘要] 目的:探讨益气化瘀方对大鼠神经再生修复过程中神经肌肉接头部神经细胞 黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)的作用。方法:大鼠L5神经根损伤后,予以益气化瘀方分别治疗10、20和30 d。采用免疫组织化学和激光共聚焦扫描显微镜技术, 观察大鼠比目鱼肌神经肌肉接头部NCAM的分布变化。采用α金环蛇毒萤光结合剂显示乙酰胆 碱受体(a...

医药学论文-益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用
医药学论文-益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用 作者:周重建,马迎辉,舒冰,王拥军,施杞 【关键词】 ,神经肌肉接头 [摘要] 目的:探讨益气化瘀方对大鼠神经再生修复过程中神经肌肉接头部神经细胞 黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)的作用。方法:大鼠L5神经根损伤后,予以益气化瘀方分别治疗10、20和30 d。采用免疫组织化学和激光共聚焦扫描显微镜技术, 观察大鼠比目鱼肌神经肌肉接头部NCAM的分布变化。采用α金环蛇毒萤光结合剂显示乙酰胆 碱受体(acetylcholine receptor, AChR),NIH图像分析系统定量测定NCAM与AChR的重叠面积。结果:益气化瘀方组NCAM在神经肌肉接头部的聚集、出芽、延伸以及与AChR的重叠面积均明显优于模型组。结论:NCAM的表达与AChR的神经支配情况密切相关。益气化瘀方 可促进神经的再生修复。 [关键词] 神经肌肉接头; 神经再生; 益气化瘀方; 神经细胞黏附分子 Effects of Yiqi Huayu Recipe on neural cell adhesion molecule in rats with lumbar nerve root compression ABSTRACT Objective: To study the effects of Yiqi Huayu Recipe on neural cell adhesion molecule (NCAM) in neuromuscular junctions during nerve regeneration in rats with lumbar nerve root compression. Methods: The rats with lumbar nerve root compression were given Yiqi Huayu Recipe for 10, 20 and 30 days respectively. The distribution of NCAM in neuromuscular junctions of soleus muscle in rats was examined with immunohistochemical method and confocal laser scanning microscopy technique. The acetylcholine receptor (AChR) was visualized with fluoresceinconjugated αbungarotoxin (αBTX). The overlap areas of NCAM and AChR sites were measured with NIH image technique. Results: The aggregates, sprouts and extensions of NCAM in the neuromuscular junctions and the overlap areas of NCAM and AChR sites in the Yiqi Huayu Recipetreated group were all better improved than those in the untreated group. Conclusion: The expression of NCAM is regulated according to the state of innervation for muscles. Yiqi Huayu Recipe may accelerate this nerve regeneration process. KEY WORDS neuromuscular junction; nerve regeneration; Yiqi Huayu Recipe; neural cell adhesion molecule 神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)属于诱导性蛋白,这种细胞表面糖蛋白[1]广泛存在于发育中的神经系统,通过其自身所携带的大糖分子结构多唾液 酸(polysialic acid, PSA)减弱NCAM与相邻其他细胞黏附分子之间的黏附性以介导细胞之 间的黏附,参与控制神经元生长、发育的一系列过程,包括细胞迁移、突起生长、对靶的识 别及调节细胞间的相互作用[2]。实验证明,骨骼肌失神经支配后,其神经肌肉接头部细胞 外基质中NCAM分子的表达将随之发生改变,这种变化对于稳定神经肌肉间的接触及促进运动 终板的重新构筑具有重要作用[3]。由黄芪、麝香、川芎等组成的益气化瘀方具有益气化瘀、 行气通络的作用,在治疗因椎间盘突出等原因所致的神经根损伤方面疗效显著[4]。前期实验证实,益气化瘀方对神经纤维[5]和施万细胞[6]有明显的促进作用,在此基础上我们 进一步观察大鼠L5神经根受压后比目鱼肌神经肌肉接头部NCAM的形态变化,探讨该方促进神经再生的作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 选择胚胎期2周(E14)和出生后2周(P14)的SD大鼠,以及3月龄清洁级SD雄性成年大鼠各8只作为正常对照组;另选3月龄清洁级SD雄性成年大鼠48只(上海中医药大学动物实验中心提供),体质量300~320 g,随机分为L5受压后10 d、 20 d、30 d模型组和益气化瘀方治疗10 d、20 d、30 d组,每组8只。 1.2 造模方法与取材 采用本所1999年建立的腰神经根压迫造模方法[7]。造模后经预定观察时间,予以大鼠乙醚麻醉,打开胸腔,用0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline, PBS)100~300 ml(pH 7.6)行心内灌注,采用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PB)(pH 7.4)稀释的4%多聚甲醛进行前固定,取手术侧和自体对照 侧(未行手术)比目鱼肌进行对比观察,发现所有手术侧的肌肉体积均小于对照侧。用大头 针将标本固定(防止肌肉收缩)后放入小盘中,采用上述固定液行后固定6~8 h,去除肌肉周围结缔组织后逐级浸入0.1 mol/L PB(pH 7.4)以及稀释的10%、15%、20%蔗糖溶液中予以冻结保护,将标本置于包埋液中,立即用液氮冷冻并置于深低温冰箱中备用。采用恒冷(- 20?)切片机行标本纵切片(厚度50 μm),置于含0.01 mol/L PBS的容器内,保存于4 ?冰箱。 1.3 药物 益气化瘀方由黄芪15 g、川芎12 g、丹参9 g、防己15 g、人工麝香0.03 g组成。大鼠给药剂量按人与动物体质量比予以换算,相当于临床体质量60 kg人的用药剂量,即予以生药5.03 g・kg-1・d-1。造模后第2天,益气化瘀方治疗各组 分别灌胃给药10、20和30 d,1次/d;正常对照组和模型组则予以等量生理盐水。 1.4 免疫组织化学 1.4.1 NCAM染色 预初实验表明,游离切片的染色强度明显优于载玻切片,因此免疫 组化染色均采用游离切片。切片分别经0.01 mol/L PBS和0.4% TritonX/PBS冲洗2次后,置于含0.05% NaN3和1%小牛血清白蛋白的PBS液中孵化2~3 h,加入多克隆抗NCAM(5~10 mg/L)后置于4?冰箱中24 h,PBS液冲洗3次,再加入第二抗体Texas Red、抗兔IgG(美国Jackson 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 提供),稀释度1?200,在室温中显色4 h,肌内神经纤维呈红色为阳 性反应。 1.4.2 乙酰胆碱受体染色 比目鱼肌突触后膜的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)用2 mg/L α金环蛇毒(αbungarotoxin, αBTX)萤光结合剂染色,置于 37?烘箱中2~4 h。切片经PBS液多次冲洗后,封片胶封片,绿色为阳性反应。 1.5 显微图像分析 采用萤光显微镜(德国Zeiss Axiophot公司产品)观察αBTX萤光结合剂和Texas Red双重染色切片,然后采用装有氩和氩离子的LSMGB200激光共聚焦扫描显微镜(日本Olympus公司产品)观察其复染物质,使用488 nm激发αBTX,568 nm激发Texas Red,为了降低假阳性率,每张切片分1波道和2波道分别拍摄,然后加以重叠,最后经计算 机处理成清晰的双重染色图像。采用NIH图像分析系统(美国Apple公司产品)测量运动终 板与NCAM的重叠面积。每组动物随机选取10张切片,以运动终板整个平面为测量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,采 用密度形式测量其面积。侧面像的运动终板均被剔除,以确保测量精确性。 1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 8.0软件予以统计学处理,计量资料均数用x?s表示,两样本均数比较采用t检验。 2 结果 2.1 E14、P14及正常成年大鼠AChR和NCAM在肌肉中的分布变化 E14、P14及正常成年大鼠AChR斑的形态均呈圆形或椭圆形,边缘光滑,着色均匀;而三者NCAM在神经肌肉接头部的分布却大不相同。E14大鼠从轴突至末梢神经NCAM均呈深度染色,与AChR形成较好的重叠,运动终板周围无明显突起;P14大鼠上述区域NCAM染色强度明显减弱,与AChR的重叠面积亦明显下降;正常成年大鼠除神经肌肉接头部可见到极少量未与AChR重叠的NCAM反应产物外,其余均已基本消褪。见图1。 图1 E14、P14及正常成年大鼠AChR和NCAM在肌肉中的分布变化(略) Figure 1 Double fluorescence labeling for NCAM (red) and AChR (green) in longitudinal sections of soleus muscles in 14day embryonic rats, 14day postnatal rats and adult rats Red and green stainnings obtained simultaneously were superimposed to show apposition, which appears yellow between NCAM and postsynaptic AChR plaques.AC: Intense immunoreactivity for NCAM is found throughout the axons and axon terminals in embryonic rats. The cholinesterase staining in the endplates with αBTX shows being distributed in a characteristic curved band with smooth edges.DF: Immunoreactivity for NCAM is reduced distinctly from axon to terminal in 14day postnatal rats, and the area of contact cholinesterase is decreased too.GI: Immunoreactivity for NCAM disappeared in the neuromuscular junction except AChR site where the NCAM staining shows very faint. The ringshaped AChR plaques in normal adult rats comprise multiple AChRrich branches where AChR are uniformly distributed. Scale bar: 20 μm. 2.2 L5神经根受压后10、20和30 d模型组与益气化瘀方组AChR和NCAM在肌肉中的分布变化 L5神经根受压后10 d,模型组和益气化瘀方组AChR斑轮廓模糊、结构紊乱、密度降低,模型组尚可见到AChR斑皱缩和碎裂现象;此时,NCAM已重新在运动终板区域出现积聚和增生,但无论是染色强度还是范围,益气化瘀方组均明显优于模型组;同时,益气化 瘀方组已能见到少量AChR与NCAM的重叠区域及从终板边缘伸出的神经细芽。随着时间的推 移,AChR斑的形态渐趋规则,NCAM反应也逐步增强,至造模后20 d达到最高峰,但益气化瘀方组仍然明显优于模型组,其不仅在数值上超过了胚胎期大鼠,且与AChR全部重叠;而模型组仍可见到不少重叠不全且形态异常的AChR斑。L5神经根受压后30 d,NCAM的表达水平开始下降,基本局限于终板区内,其下降速度和范围在益气化瘀方组明显大于模型组;模型 组不仅NCAM的表达明显高于益气化瘀方组,且仍能见到一些成熟不全的AChR斑;而益气化瘀方组AChR斑形态已接近于正常。上述结果提示,益气化瘀方对AChR的神经再支配具有明显的促进作用。见图2。 2.3 神经肌肉接头部NCAM与AChR的重叠面积的测定 E14胚胎期大鼠为278.6 μm2,P14大鼠为104.2 μm2,正常成年大鼠为14.4 μm2,L5神经根受压后10、20、30 d模型组和益气化瘀方治疗10、20、30 d组的重叠面积分别为47.7、215.6、119.5和98.3、288.8、72.1 μm2。益气化瘀方组与模型组比较有统计学差异(P<0.05),提示NCAM的表达与AChR的成熟呈反比关系,益气化瘀方在神经再生修复过程中可明显促进NCAM的增殖及运动终板的神经再支配。见图3。 图2 模型组和益气化瘀方组大鼠AChR和NCAM在肌肉中的分布变化(略) Figure 2 Confocal laser scanning photomicrographs of double stainning for NCAM and AchR in the untreated groups and the Yiqi Huayu Recipetreated groups A: Untreated group on the 10th day after L5 nerve root compression. The intensity of NCAM staining is very weak at neuromuscular junction, and the AChR plaques display apparent granular or loss of uniformity of edge thickening (arrowheads).B: Yiqi Huayu Recipetreated group on the 10th day after L5 nerve root compression. The intensity of NCAM staining in this picture is stronger than that of the untreated group. The sprouts from endplate (arrows) and a few contact sites (arrowheads) of NCAM with AChR can be seen.C: Untreated group on the 20th day after L5 nerve root compression. There are some AChR plaques of morphological abnormality (arrows), and no contact sites of NCAM with AChR although the intensity and scope of NCAM staining is increased.D: Yiqi Huayu Recipetreated group on the 20th day after L5 nerve root compression. All the AChR sites are reoccupied by NCAM and the morphology of AChR are restored. E: Untreated group on the 30th day after lumbar nerve root compression. AChR plaques display irregularity in shape, with a few round or spindle shaped cupulae. Meanwhile, some NCAM stainings are still shown to be around the AChR. F: Yiqi Huayu Recipetreated group on the 30th day after L5 nerve root compression. The shape of AChR plaques is close to the normal and the staining of NCAM has nearly disappeared. Scale bar: 20 μm. 图3 各组大鼠神经肌肉接头部NCAM与AChR重叠面积的变化(略) Figure 3 Overlap areas of NCAM and AChR sites in neuromuscular junctions of rats in different group The intensity of NCAM, which is very strong at embryonic stage of rats, is gradually decreased during the developing stage and nearly disappears until adult stage. The NCAM reappears after nerve root compression and is gradually decreased according to the regeneration condition in neuromuscular junction. The effect of Yiqi Huayu Recipe on degeneration and regeneration is better than that of the untreated group (*P<0.05). 3 讨论 本实验观察了E14胚胎期、P14及正常成年大鼠NCAM在神经肌肉接头部的不同分布,以 及L5神经根受压后10、20和30 d,益气化瘀方在神经再生修复过程中对NCAM的作用。实验结果显示,益气化瘀方组在神经再生修复早、中期,无论是NCAM染色强度、范围还是神经芽的生长速度及与运动终板的重叠面积均明显优于模型组,表明益气化瘀方不仅对NCAM增殖有明显的促进作用,而且在神经再生修复早期能明显加快变性AChR的重新构筑。L5神经根受压后,模型组和益气化瘀组NCAM与AChR的重叠面积均呈由低到高趋势,但益气化瘀方组 重叠面积明显大于模型组,且上升趋势更快;至L5神经根受压20 d时,益气化瘀方组已基本全部重叠,而模型组仍有30%的终板没有被NCAM覆盖。 本实验发现,在突触发生期间,胚胎肌管上含有丰富的NCAM,但在发育过程中其含量逐渐下降,至成年期突触完全成熟且肌肉处于高度的神经支配不应期时,除突触内含有极少量 NCAM外,其肌纤维表面和肌内神经区域NCAM已全部消退。由此我们推测,NCAM在肌内的表达水平是根据肌肉神经支配情况进行调节的。从胚胎期到成年期,NCAM的变化标志着神经元与神经元间以及神经元与肌纤维间相互接触而趋于稳定,也包括了运动终板的成熟。在神经 根损伤后的早期,从NCAM再次积聚于肌肉运动终板突触及其周围肌纤维表面以及神经再生通 过的细胞间质内来看,变性的轴突能够提供促使NCAM积聚的信号从而影响轴突的生长,尽管 目前对此信号的实质尚未完全了解;同时,亦说明AChR斑形态的维持和功能发挥与神经末梢 释放的信息之间关系密切。神经根一旦受压损伤后,神经末梢对运动终板的信息释放即停止 或减少,导致运动终板变性,突触内部结构如小囊、接合褶等可发生萎缩或裂解等一系列的 改变。随着时间的推移,NCAM在神经肌肉接头部的表达逐渐增加,于L5神经根受压后第20天达到峰值。此时,NCAM的大量聚集不仅为轴突延伸提供了有用的基质,同时也和末梢神经 功能重建的启动相关,表明NCAM在神经细胞和肌细胞之间的相互黏附上起着重要的作用。L5神经根受压后第30天,NCAM在神经肌肉接头部的积聚开始逐渐减退,推测其原因:(1)大鼠运动终板的神经再生期是在神经根损伤后3周内;(2)NCAM与AChR神经再支配有密切关联,NCAM在运动终板的重新构筑和神经再支配过程中均起重要作用;(3)神经肌肉接头部NCAM的表达与AChR的成熟程度呈反比关系。 在细胞发育、分化及创伤修复过程中都会发生细胞的移动,但对于其机制的了解迄今尚 未明确,但可以肯定的是细胞黏附分子是这一过程的重要参与者。NCAM内含有乙酰神经氨酸的多聚物。在哺乳类动物中,NCAM是这种多聚物的主要携带者,对轴突生长具有一定的促进 作用。肌肉失神经支配后,肌内运动神经通过延伸、成束、分枝而使变性的运动终板重新获 得神经再支配。在此过程中,细胞间的相互作用、膜与膜的对合、轴突与轴突或轴突与基质 的黏附均需乙酰神经氨酸多聚物作为各种配基的媒介或激活其第二信使。失神经支配的肌肉 利用其细胞表面和细胞外基质成分以影响再生轴突的行为,并为细胞间相互作用的信息传递 提供了分子基础。近年来的研究显示,NCAM可调节神经细胞之间及神经细胞与肌纤维之间的 相互作用,其在肌肉再生修复过程中具有关键作用[8],我们的实验亦证实了这一点。 施万细胞含有促进细胞黏附、迁移及轴突生长的分子,如层黏连蛋白、NCAM和纤维结合 蛋白等,同时还可合成多种促进轴突生长的因子,如神经生长因子、脑源性神经营养因子、 胰岛素样生长因子等,在促进神经再生修复方面起着重要的作用,其刺激轴突生长及相互作 用的分子基础一直为广大学者所关注。以往的研究证实益气化瘀方对于末梢施万细胞的增殖 及轴突生长具有明显的促进作用[9]。在本实验中,NCAM在运动终板部的增殖高峰与我们过去研究发现的施万细胞增殖时间是一致的。因此,我们推测NCAM的增殖与黏附作用很可能是由施万细胞所介导的。当神经纤维受到损伤后,处于静止期的施万细胞被激活,并能自身分 泌上述促神经生长因子,营养、支持神经细胞的增殖代谢及调控轴突的生长,为神经再生提 供一个合适的微环境。由于施万细胞和肌纤维的基底膜鞘含有影响轴突延伸及指导突触形成 的信息,在轴突和肌管再生期间通过NCAM的“桥梁”作用,将此信息输送到神经肌肉接头部, 最终促使神经肌肉接头恢复其原有的功能。 本实验结果表明,益气化瘀方可明显促进NCAM的增殖、延伸,使其快速到达运动终板并与AChR发生重叠,促进运动终板早日成熟。综观益气化瘀方,麝香活血通络、散结止痛;黄 芪益气升阳、固表内托、利水退肿;川芎行气活血、祛风止痛。现代药理研究证实,人工麝 香可通过抑制5羟色胺和组织的免疫反应,降低毛细血管通透性并抑制白细胞游出而发挥其 抗炎作用[10]。黄芪注射液对培养的施万细胞具有轻度的促增殖作用[11],并能改善创伤 后的细胞免疫功能。含有汉防己甲素的防己既能降低大鼠急性炎症时血管的通透性,又可改 善微循环。川芎具有扩张血管、改善血液流变性及促进血液循环的作用。此外,动物实验表 明,川芎嗪对机体的非特异性防御功能及细胞介导的免疫功能均有促进作用。由此我们认为, 益气化瘀方可以提高神经损伤后的机体免疫功能,同时更大程度地改善和促进局部组织的血 液循环和新陈代谢,为施万细胞的增生创造了有利的微环境,促使施万细胞释放更多的能增 强再生神经生长的各种促神经营养因子,并通过施万细胞浆膜或基底膜的分泌形成适合神经 末梢生长的NCAM,最终加快神经的再生修复进程。神经肌肉接头部施万细胞与NCAM的关系, 其来源及引起信号积聚的机制等均值得进行更深入的研究。 [参考文献] 1Ricard CS, Pena JD, Hernandez MR. 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