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首页 [doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析

[doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析.doc

[doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析

骨子里滴骄傲
2017-10-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《[doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析doc》,可适用于社会民生领域

doc格式个鸡品种TPK基因的PCRSSCP分析个鸡品种TPK基因的PCRSSCP分析第卷第期年月扬州大学(农业与生命科学版)JournalofYangzhouUniversity(AgricuhuralandLifeScienceEdition)VoNoJun个鸡品种TPK基因的PCRSSCP分析孟春玲,徐琪,王克华,包文斌,陈国宏(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州中国农业科学院家禽研究所,江苏扬州)摘要:以鸡硫胺焦磷酸激酶(TPK)基因为候选基因,隐性白羽鸡,泰和乌骨鸡,萧山鸡,白耳鸡为试验材料,采用PCRSSCP方法对TPK所有外显子及一调控区进行单核苷酸多态性(SNP)筛查,探讨不同基因型与不同鸡品种肌肉硫胺素含量的关系结果表明:在一调控区发现了个SNP位点,其纯合子AA型与船型相比有一个CT的单碱基突变,cc型与船型相比有一个CA的单碱基突变等位基因和的频率极显着高于等位基因C的频率,且泰和乌骨鸡与白耳鸡差异显着,故推测所检测到的基因座与肌肉硫胺素含量相关关键词:鸡硫胺焦磷酸激酶单核苷酸多态性PCRSSCP中图分类号:S文献标识码:A文章编号:()AnalysisofTPKgeneinfourchickenbreedsbyPCRSSCPMENGChuning,XUQi,WANGKehua,BAOWenbin,CHENGuohong(CoUofAnimSciandTech,YangzhouUniv,Yangzhou,ChinaInstofPoultrySci,ChineseAcadofAgricSci,Yangzhou,China)ABSTRACT:Thisstudywasdesignedtoinvestigatethesinglenucleotidepolymorphism(SNP)ofKgeneinvariousbreeds,includingRecessiveWhitechickensTaiheSilkieschickensXiaoshanchickensandBaierchickensTheprimersforalltheexonsand一UTRingeneweredesignedandtheSNPwasdetectedbyPCRSSCPandDNAsequencingOBeSNPwasdetectedintheUTRThesequencingresultsindicatedthatBBgenotypeshadonlyonebasedifferencewithAAgenotypesCT,whileCCgenotypehadonlyonebasedifferencewithBBgenotypeCATheanalyticresultsshowedfrequenciesofalleleBorAandalleleCweresignificantlydifferent(P)whileTaiheSilkieschickensandBaierchickensweredifferent(P),itcouldconcludethattheSNPmayhaverelationshipwiththiaminecontentKEYWORDS:chickenTPKgenesinglenucleotidepolymorphismPCRsinglestrandconformationpolymorphism肉的风味主要包括滋味和香味个方面,滋味来源于肉中的滋味呈味物质如肌苷酸(IMP)肉香味主要是由肌肉基质在受热过程中产生的挥发性风味物质(如不饱和醛酮,含硫化合物)以及一些杂环化合物(如硫胺素)有关构成肌肉鲜味和香味的主要成分之一的IMP含量相关候选基因的研究已有报道束婧婷等…以ADSL基因为IMP含量的候选基因,分析了其在泰和乌骨鸡,白耳鸡等个肉鸡品种中基因型分布与IMP含量的关系但对于构成肌肉香味的另一主要成分的硫胺素含量相关候选基因的研究迄今尚未见报道硫胺素在体内的合成,代谢过程十分复杂,从开始合成共涉及多种关键酶,硫胺焦磷酸激酶(TPK)是硫胺素代谢过程中的关键酶之一国内外对该酶的研究主要集中于QTL定位人们研究发现,曲霉菌TPK基因定位于号染色体J,日本水稻基因定位于号染色体,狗TPK基因定位于号染色体,黑猩猩K基因定位于号染色体j,人TPK基因定位于号染色体的q,q鸡TPK基因被定位于号染色体,包含个外显子本试验以鸡硫胺素代谢相关酶中的TPK基因为候选基因,在泰和乌骨鸡,白耳鸡,萧山鸡个地方鸡品种和个引收稿日期:l基金项目:江苏省”六大人才”高峰项目()作者简介:孟春玲(,),女,河北衡水人,扬州大学硕士研究生,主要从事动物资源评价,保护和利用研究联系作者,Email:ghchenyzueducn扬州大学(农业与生命科学版)第卷进的隐性白羽鸡品种,对鸡的K基因外显子及一调控区进行单核苷酸多态性(SNP)分析,探讨不同基因型与不同鸡品种肌肉硫胺素含量的关系,以期从分子水平上探明我国地方鸡品种特异香味形成机理,为地方鸡品种肉品质的开发利用提供理论依据材料与方法供试动物及主要试剂采用保种群简单随机抽样方法,从中国农业科学院家禽研究所国家地方禽种资源基因库保种群中随机抽取周龄泰和乌骨鸡,萧山鸡,白耳鸡和隐性白羽鸡母鸡各只,翅静脉采血,每只mL,肝素钠抗凝,加裂解液mL,用酚氯仿抽提法提取基因组DNA,溶于TE中,冷藏保存备用TaqDNApolymerase,dNTP购自北京鼎国生物公司引物设计和PCR扩增根据GenBank上鸡的TPK序列(GenBank登录号为XM一)与鸡的全部基因组序列相比对,采用PrimerPremier,Oligo等引物设计软件,共设计对特异引物,用于扩增TPK基因的所有个外显子及一调控区(表)引物由上海生工生物工程公司合成表引物核苷酸序列TabThesequenceofprimerPCR扩增反应体系中,×PCR缓冲液IxL,mmolL,dNTPIxL,I,zmolL引物L,Taq酶U,ngLDNA模板IxL,双蒸水IxLPCR反应程序:预变性min变性S,,退火S,延伸S,共个循环再延伸min反应产物于保存PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统分析检测扩增结果SSCP分析LPCR产物中加入上样缓冲液甲酰胺,溴酚蓝,二甲苯青,lmmolLEDTA(pH),甘油,IxL,变性min,冰浴min,保持变性状态变性后产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,V电泳,h,银染显色测序根据PCRSSCP分析结果,选取不同基因型的纯合子(或杂合子)进行测序PCR产物经电泳鉴定后,用胶回收试剂盒(加拿大BBI公司)回收目标片段,纯化后由上海生工生物工程公司测序第期孟春玲等:个鸡品种TPK基因的PCRSSCP分析结果与分析PCRSSCP分析结果所有引物经PCR扩增后均获得较好的结果,片段长度与所设计的大小一致,且无非特异性条带,可用于SSCP分析PCRSSCP分析结果发现,在引物P中存在多态性,其他引物无多态性P扩增的片段有种基因型,分别定义为AA,BB,AB,CC,AC(图)图引物PPCR扩增产物的SSCP分析序列分析结果FigSSCPanalysisonPCRproductofprimer取AA,BB和cc种基因型的PCR产物片段进行,AB型型BB型CC型AC型纯化测序,结果表明BB型与GenBank(登录号为XM一)中的序列一致,定义为野生型型与BB型相比有一个CT的单碱基突变,cc型与BB型相比有一个CA的单碱基突变,定义为突变型将突变型的核苷酸序列演绎成氨基酸序列后,发现突变后该处的氨基酸未发生改变,因此该突变为沉默突变(图)TGGGArAGAACCGGTGGGACAGAACCGGCTGGGAAAGAACCGaCAA型BB型CC型图AA,BB和CC基因型各处突变的测序峰图FigThemutationsbetweenAA,BBandCCgenotype个鸡品种TPK基因的基因频率和基因型频率根据电泳图谱显示的表型,统计基因型频率分别对引物P不同基因型在个鸡品种间的分布进行检验,以观察各群体是否处于HardyWeinberg平衡由表可见,泰和乌骨鸡显着偏离HardyWeinberg平衡(P),白耳鸡极显着偏离HardyWeinberg平衡(P)隐性白羽鸡,萧山鸡和白耳鸡均以AB型,AA型分布较多,所有鸡品种以AC型分布较少表个鸡品种TPK基因的PCRSSCP的基因频率和基因型频率TabGenefrequencyandgenotypefrequencyofTPKgeneinfourchickenbreeds括号内的数据为该基凼型玛的个体数个鸡品种TPK基因不同基因型分布差异检验不同鸡品种TPK基因的基因型分布差异检验结果显示,除泰和乌骨鸡与白耳鸡差异显着(P)外,其他鸡品种间差异均不显着(P)讨论目前,国内外有关硫胺素的研究大多集中于因营养,代谢及营养缺乏时所产生的疾病方面,有关肌扬州大学(农业与生命科学皈)第卷肉硫胺素含量的候选基因或相关遗传标记的研究报道则相对较少Dwivedi等曾报道硫胺素热降解后可产生硫化氢,一乙酰一一巯基丙醇,一巯基丙醇,一甲基一一乙烯基噻唑及呋喃,噻吩,其水溶液加热后则可产生碳酰化合物,呋喃,噻吩,噻唑,二嗯茂及其他含硫化合物,这些分解物多数具有煮肉的诱人香味,可产生鸡肉特有的风味但未见从分子水平上的研究报道本试验以鸡硫胺素代谢关键酶中的基因为候选基因,利用PCRSSCP和测序法分析了该基因所有个外显子及一调控区的核苷酸变异,结果在一调控区发现个SNP,对该多态位点的种纯合子进行测序,结果表明型与BB型相比有一个CT的单碱基突变,CC型与BB型相比有一个CA的单碱基突变,均为同义突变,氨基酸未发生变异,而整个基因的其他片断并未发生变异,说明该基因高度保守这一位点是否会影响TPK基因的表达,还需要对不同基因型个体采用定量或半定量RTPCR等方法进行验证,也可通过对不同基因型个体血液中细胞因子的水平进行检测加以研究在本试验中,对一调控区的统计分析表明,基因型频率和基因频率分布与品种有关经计算种基因型在不同鸡品种中分布频率,等位基因A和日的频率较高,且泰和乌骨鸡与白耳鸡差异显着,但与其他鸡品种差异不显着这与陈国宏等报道的地方鸡品种间肌肉硫胺素含量存在差异相一致,白耳鸡肌肉硫胺素含量最高,显着高于乌骨鸡,萧山鸡由此推测,本研究所检测到的基因座很可能与肌肉硫胺素含量相关,该SNP可否作为肌肉风味的候选分子标记,尚有待于进行更深入的研究参考文献束婧婷,包文斌,张红霞,等家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系J遗传,,():NiermanWC,PainA,AndersonMJGenomicsequenceofthepathogenicandallergenicfilamentousfungusAspergillusfumigatusJNatureGenetics,,():MatsumotoT,WuJ,KanamoHtt,etaThemapbasedsequenceofthericegenomeJNatureGenetics,,():ZhaoS,ShatsmanS,AyodejiB,etaMouseBACendsqualityassessmentandsequenceanalysisJGenomeRes,,():KirschIR,GreenED,YoneseuR,etaAsystematic,highresolutionlinkageofthecytogeneticandphysical印softhehumangenomeJNatureGenetics,():ZhangZ,SchwartzS,WagnerL,etaAgreedyalgorithmforaligningDNAsequencesJComputBil,,():FradinD,BougneresPThreecommonintronicVariantsinthematernalandfetalthiaminePYrophosphokinasegene(TPK)areassociatedwithbirthweightJAnnHumGenet,,():DwivediBK,ArnoldRGChemistryofthiaminedegradationinfoodproductsandmodelsystemsincludingsimulatedmilksystems:areviewJJournalofAgriculturalandFoodChemistry,,():DwivediBKTheroleofenzymesinfoodflavour(I):dairyproductsJCRCCriticalReviewsinFoodTechnolgY,():陈国宏,罗方妮,王克华,等中国部分地方鸡品种肌肉硫胺素含量比较研究J江苏农学院,,():(责任编辑张立元)

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