[doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析

[doc格式] 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析 第29卷第2期 2008年6月 扬州大学(农业与生命科学版) JournalofYangzhouUniversity(AgricuhuralandLifeScienceEdition) Vo1.29No.2 Jun.2008 4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析 孟春玲,徐琪,王克华,包文斌,陈国宏 (1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009;2.中国农业科学院家禽研究所,江苏扬州225003) 摘要:以鸡硫胺焦磷酸激酶(TPK1)基因为候选基因,隐性白羽鸡,泰和乌骨鸡,萧山鸡,白耳鸡为试验材料,采用PCR— SSCP方法对TPK1所有外显子及3一调控区进行单核苷酸多态性(SNP)筛查,探讨不同基因型与不同鸡品种肌肉硫胺素 含量的关系.结果表明:在3一调控区发现了1个SNP位点,其纯合子AA型与船型相比有一个C2132T的单碱基突变, cc型与船型相比有一个C2132A的单碱基突变.等位基因4和的频率极显着高于等位基因C的频率,且泰和乌骨 鸡与白耳鸡差异显着,故推测所检测到的基因座与肌肉硫胺素含量 相关. 关键词:鸡;硫胺焦磷酸激酶;单核苷酸多态性;PCR—SSCP 中图分类号:S831.2文献标识码:A文章编 号:1671—4652(2008)02—0039—04 AnalysisofTPK1geneinfourchickenbreedsbyPCR-SSCP MENGChun.1ing,XUQi,WANGKe-hua,BAOWen-bin,CHENGuo?hong (1.CoUofAnimSciandTech,YangzhouUniv,Yangzhou225009,China; 2.InstofPoultrySci,ChineseAcadofAgricSci,Yangzhou225003,China) ABSTRACT:Thisstudywasdesignedtoinvestigatethesinglenucleotidepolymorphism(SNP)ofK1geneinvariousbreeds, includingRecessiveWhitechickens.TaiheSilkieschickens.XiaoshanchickensandBaierchickens.Theprimersforallthe7 exonsand3一 UTRin1geneweredesignedandtheSNPwasdetectedbyPCR—SSCPandDN Asequencing.OBeSNPwasde— tectedinthe3UTR.ThesequencingresultsindicatedthatBBgenotypeshadonlyonebasedifferencewithAAgenotypes C2132T,whileCCgenotypehadonlyonebasedifferencewithBBgenotypeC2132A.Theanalyticresultsshowedfrequenciesof alleleBorAandalleleCweresignificantlydifferent(P<0.01).whileTaiheSilkieschickensandBaierchickensweredifferent (P<0.05),itcouldconcludethattheSNPmayhaverelationshipwiththiami necontent. KEYWORDS:chicken;TPK1gene;singlenucleotidepolymorphism;PCR —singlestrandconformationpolymorphism 肉的风味主要包括滋味和香味2个方面,滋味来源于肉中的滋味呈味物质如肌苷酸(IMP);肉香 味主要是由肌肉基质在受热过程中产生的挥发性风味物质(如不饱和醛酮,含硫化合物)以及一些杂环 化合物(如硫胺素).有关构成肌肉鲜味和香味的主要成分之一的IMP含量相关候选基因的研究已有 报道.束婧婷等…以ADSL基因为IMP含量的候选基因,分析了其在泰和乌骨鸡,白耳鸡等5个肉鸡品 种中基因型分布与IMP含量的关系.但对于构成肌肉香味的另一主要成分的硫胺素含量相关候选基 因的研究迄今尚未见报道.硫胺素在体内的合成,代谢过程十分复杂,从开始合成共涉及10多种关键 酶,硫胺焦磷酸激酶(TPK1)是硫胺素代谢过程中的关键酶之一.国内外对该酶的研究主要集中于QTL 定位.人们研究发现,曲霉菌TPK1基因定位于7号染色体J,日本水稻1基因定位于1号染色 体,狗TPK1基因定位于16号染色体,黑猩猩K1基因定位于7号染色体j,人TPK1基因定位 于7号染色体的q34,q35.鸡TPK1基因被定位于2号染色体,包含7个外显子.本试验以鸡硫 胺素代谢相关酶中的TPK1基因为候选基因,在泰和乌骨鸡,白耳鸡,萧山鸡3个地方鸡品种和1个引 收稿日期:2007—12—1l 基金项目:江苏省”六大人才”高峰项目(2006-09) 作者简介:孟春玲(1982,),女,河北衡水人,扬州大学硕士研究生,主要从事动物资源评价,保护和利用研究. 联系作者,E—mail:ghchen@yzu.edu.cn 扬州大学(农业与生命科学版)第29卷 进的隐性白羽鸡品种,对鸡的K1基因外显子及3一调控区进行单核苷酸多态性(SNP)分析,探讨不同 基因型与不同鸡品种肌肉硫胺素含量的关系,以期从分子水平上探明我国地方鸡品种特异香味形成机 理,为地方鸡品种肉品质的开发利用提供理论依据. 1材料与方法 1.1供试动物及主要试剂 采用保种群简单随机抽样方法,从中国农业科学院家禽研究所国家地方禽种资源基因库保种群中 随机抽取12周龄泰和乌骨鸡,萧山鸡,白耳鸡和隐性白羽鸡母鸡各30只,翅静脉采血,每只0.5mL, 肝素钠抗凝,加裂解液5mL,用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,溶于TE中,4?冷藏保存备用.Taq DNApolymerase,dNTP购自北京鼎国生物公司. 1.2引物设计和PCR扩增 根据GenBank上鸡的TPK1序列(GenBank登录号为XM一418875)与鸡的全部基因组序列相比对, 采用PrimerPremier5.0,Oligo6.0等引物设计软件,共设计15对特异引物,用于扩增TPK1基因的所有 7个外显子及3一调控区(表1).引物由上海生工生物工程公司合成. 表1引物核苷酸序列 Tab.1Thesequenceofprimer PCR扩增反应体系中,10×PCR缓冲液2IxL,2.5mmol?L,dNTP1IxL,10I,zmol?L引物 0.6L,Taq酶1.0U,100ng?LDNA模板1IxL,双蒸水14.8IxL.PCR反应程序:94?预变性 5min;94?变性50S,49,60?退火50S,72?延伸50S,共34个循环;72?再延伸10min.反应 产物于4?保存.PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统分析检测扩增结果. 1.3SSCP分析 5LPCR产物中加入上样缓冲液[98%甲酰胺,0.025%溴酚蓝,0.025%二甲苯青,l0mmol?L EDTA(pH8.0),2%甘油]5,6IxL,98?变性10min,冰浴5min,保持变性状态.变性后产物在 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,150V电泳6,9h,银染显色. 1.4测序 根据PCR—SSCP分析结果,选取不同基因型的纯合子(或杂合子)进行测序.PCR产物经电泳鉴定 后,用胶回收试剂盒(加拿大BBI公司)回收目标片段,纯化后由上海生工生物工程公司测序. 第2期孟春玲等:4个鸡品种TPK1基因的PCR—SSCP分析41 2结果与分析 2.1PCR-SSCP分析结果 所有引物经PCR扩增后均获得较好的结果,片段 长度与所设计的大小一致,且无非特异性条带,可用于 SSCP分析.PCR—SSCP分析结果发现,在引物P5中存在 多态性,其他引物无多态性.P扩增的片段有5种基因 型,分别定义为AA,BB,AB,CC,AC(图1).图1引物P.PCR扩增产物的SSCP分析 2.2序列分析结果Fig?1SSCPanalysisonPCRproductofprimer15 取AA,BB和cc3种基因型的PCR产物片段进行,?AB型;.?型;4?BB型;?CC型;?AC型 纯化测序,结果表明BB型与GenBank(登录号为XM一418875)中的 序列一致,定义为野生型.型与 BB型相比有一个C2132T的单碱基突变,cc型与BB型相比有一个C2132A的单碱基突变,定义为突 变型.将突变型的核苷酸序列演绎成氨基酸序列后,发现突变后该处的氨基酸未发生改变,因此该突变 为沉默突变(图2). 2132 TGGGArAGAACCGG2132 TGGGACAGAACCGGC 2132 TGGGAAAGAACCGaC AA型BB型CC型 图2AA,BB和CC基因型各处突变的测序峰图 Fig.2ThemutationsbetweenAA,BBandCCgenotype 2.34个鸡品种TPK1基因的基因频率和基因型频率 根据电泳图谱显示的表型,统计基因型频率.分别对引物P不同基因型在4个鸡品种间的分布进 行检验,以观察各群体是否处于Hardy-Weinberg平衡.由表2可见,泰和乌骨鸡显着偏离Hardy— Weinberg平衡(P<0.05),白耳鸡极显着偏离Hardy—Weinberg平衡(P<0.01).隐性白羽鸡,萧山鸡 和白耳鸡均以AB型,AA型分布较多,所有鸡品种以AC型分布较少. 表24个鸡品种TPK1基因的PCR-SSCP的基因频率和基因型频率 Tab.2GenefrequencyandgenotypefrequencyofTPK1geneinfourchickenb reeds 括号内的数据为该基凼型玛的个体数. 2.44个鸡品种TPK1基因不同基因型分布差异检验 不同鸡品种TPK1基因的基因型分布差异检验结果显示,除泰和乌骨鸡与白耳鸡差异显着(P< 0.05)外,其他鸡品种间差异均不显着(P>0.05). 3讨论 目前,国内外有关硫胺素的研究大多集中于因营养,代谢及营养缺乏时所产生的疾病方面,有关肌 42扬州大学(农业与生命科学皈)第29卷 肉硫胺素含量的候选基因或相关遗传标记的研究报道则相对较少.Dwivedi等曾报道硫胺素热降解 后可产生硫化氢,3一乙酰一3一巯基丙醇,3一巯基丙醇,4一甲基一5一乙烯基噻唑及呋喃,噻吩,其水溶液加热后 则可产生碳酰化合物,呋喃,噻吩,噻唑,二嗯茂及其他含硫化合物,这些分解物多数具有煮肉的诱人香 味,可产生鸡肉特有的风味.但未见从分子水平上的研究报道. 本试验以鸡硫胺素代谢关键酶中的1基因为候选基因,利用PCR—SSCP和测序法分析了该基因 所有7个外显子及3一调控区的核苷酸变异,结果在3一调控区发现1个SNP,对该多态位点的3种纯合 子进行测序,结果表明型与BB型相比有一个C2132T的单碱基突变,CC型与BB型相比有一个 C2132A的单碱基突变,均为同义突变,氨基酸未发生变异,而整个基因的其他片断并未发生变异,说明 该基因高度保守.这一位点是否会影响TPK1基因的表达,还需要对不同基因型个体采用定量或半定 量RT—PCR等方法进行验证,也可通过对不同基因型个体血液中细胞因子的水平进行检测加以研究. 在本试验中,对3一调控区的统计分析表明,基因型频率和基因频率分布与品种有关.经计算5种 基因型在不同鸡品种中分布频率,等位基因A和日的频率较高,且泰和乌骨鸡与白耳鸡差异显着,但与 其他鸡品种差异不显着.这与陈国宏等?.报道的地方鸡品种间肌肉硫胺素含量存在差异相一致,白耳 鸡肌肉硫胺素含量最高,显着高于乌骨鸡,萧山鸡.由此推测,本研究所检测到的基因座很可能与肌肉 硫胺素含量相关,该SNP可否作为肌肉风味的候选分子标记,尚有待于进行更深入的研究. 参考文献 [1]束婧婷,包文斌,张红霞,等.家鸡腺苷琥珀酸裂解酶基因多态性与 肌苷酸含量的关联及其与红原鸡的亲缘关系 [J].遗传,2007,29(3):343—348. 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