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细菌基因组DNA提取.doc

细菌基因组DNA提取

笑笑姚静
2017-11-30 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细菌基因组DNA提取doc》,可适用于活动策划领域

细菌基因组DNA提取细菌基因组DNA提取快速微量提取法取ml菌体培养物于一灭菌Eppendorf管中rpm离心min弃上清液收集菌体。加入ul裂解液(mMTris醋酸mM醋酸钠mMEDTASDSpH)混匀置于水浴h。然后加入ulmolL的氯化钠溶液混匀后于rpm离心min。取上清液用苯酚抽提次氯仿抽提次。加两倍体积无水乙醇体积醋酸钾MpH度保存小时后rpm离心min弃上清液沉淀用乙醇洗次置于室温干燥后溶于ulTE溶液中置保存备用。蛋白酶SDS法制备取ml菌体(如:Delftiasp)过夜培养物于一灭菌Eppendorf管中rpm离心min收集菌体。用WashingTE(mmolLTrisHClpHmmolLEDTApH)洗菌体次。将菌体充分悬浮在ml×TE缓冲液中先后加入mlmgL的蛋白酶、mlSDS轻轻混匀后放置hh。接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提次苯酚氯仿异戊醇抽提一次。氯仿抽提一次后乙醇沉淀DNA用吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中乙醇洗次干燥后溶于适当×TE或ddHO中。酚氯仿细菌收集:取ml培养物于mlEP管中室温rpm离心min弃上清沉淀重新悬浮于mlTE(pH)中(用ddHO也行。菌体裂解:加入μlmgml的溶菌酶作用h。再加molLNaClμlSDSμlmgml的蛋白酶Kμl作用h或过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)抽提:菌液均分到两个mlEP管加等体积的酚混匀室温放置min。rpm离心min。抽提氯仿异戊醇两次。(上清很粘稠吸取时应小心最好枪头尖应剪去)沉淀:加倍体积的异丙醇混匀室温放置min。rpm离心min。洗涤:沉淀用的离心乙醇洗涤。抽(凉)干后溶于μlddHO中通用方法过夜培养细菌。后收集菌体并悬浮在mlmMTrispHmMEDTA中。重悬菌体放入保存。在冰冻的悬浮物重加入mlmMTrispHmgml溶菌酶室温解冻菌体解冻后置冰上分钟。加入mlSDSmMTrispHMEDTAmgml蛋白酶K水浴分钟。用mlTris苯酚(:)抽提然后g离心分钟将上清转移到新的Ep管中必要时再重复此步骤。加入体积M醋酸钠轻柔混匀。再加入倍体积乙醇颠倒混匀。将絮状DNA转移到mlmMTrispHmMEDTAgmlRNase溶液中摇动溶解过夜。加入等体积氯仿抽提颠倒混匀g离心分钟将上清转移到新的Ep管中。加入体积M醋酸钠轻柔混匀。再加入倍体积乙醇颠倒混匀。将絮状DNA转移到mlmMTrispHmMEDTA。CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricanalysis电泳和分光光度计检测基因组DNA纯度。方法五ml细菌过夜培养液rpm离心分钟去上清液。加mlTE悬浮沉淀并加mlSDS(裂解细胞)μlmgml或mg干粉蛋白酶K(降解蛋白)混匀保温小时。加mlmolLNaCl混匀。加mlCTAB(去除多糖成分)NaCl溶液混匀保温分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇::抽提rpm离心分钟将上清液移至干净离心管。用等体积氯仿:异戊醇:抽提取上清液移至干净管中。加倍体积异丙醇颠倒混合室温下静止分钟沉淀DNA。用玻棒捞出DNA沉淀乙醇漂洗后吸干溶解于mlTE保存。如DNA沉淀无法捞出可rpm离心使DNA沉淀。如要除去其中的RNA可以按本章第三节中操作步骤处理。注:CTABNaCl溶液:gNaCl溶解于mlHO缓慢加入gCTAB加水至ml。氯仿:异戊醇:酚:氯仿:异戊醇::异丙醇乙醇TESDS蛋白酶Kmgml或粉剂molLNaCl。血液基因组DNA提取方法取(ml抗凝全血放人一支(ml离心管中加入二倍体积的红细胞裂解液((mol,LNHClmolLNaHCOmolLEDTA)混匀。室温下静置min以溶解红细胞rmin离心min使血细胞沉淀下来弃上清。重复上述操作次以彻底除去血红蛋白。直至在离心管底出现白色的白细胞沉淀。加入DNA抽提液(mmolLTrisClpH)mmolEDTA((pH)SDS)ml悬起沉淀的白细胞。水浴保温h后高速振荡s再沸水浴min后rmin离心min使细胞碎片及变性蛋白质沉淀在上清液中加入倍体积的的冰冻乙醇静置沉淀minrmin离心min弃上清自然晾干加入ulTE备用。改良CTAB法在装有血液的ml离心管中加入ul预热的xCTAB提取液和ulβ一巯基乙醇使材料完全分散在提取液中温浴约h(待冷却至室温后加入等体积的氯仿异戊醇:上下颠倒离心管温和混匀min。然后离心minrad,min(将上清液转管反复抽提次(最后一次离心min(吸取上清液加入体积的异丙醇沉降DNA轻轻颠倒次可见白色絮状沉淀室温下静置min以上。然后rad,min离心min弃上清(用uL的乙醇和无水乙醇各洗次每次离心min后弃上清。然后将离心管放在烘箱中或室温下使乙醇挥发(待总DNA干燥后加ulTE溶液和ulRNase于水浴中温浴h然后于或冰箱中保存备用(饱和氯化钠抽提法取ml抗凝全血加入mlTEpH混匀室温离心rpm分钟弃上清加入mlTEpH混匀悬浮细胞加入mgml蛋白酶Kμl(终浓度μgml)SDSμl终浓度混匀水浴消化过夜或消化小时加入体积的饱和氯化钠充分混匀静置分钟rpm离心分钟取上清于另一新管中加入等体积氯仿混匀rpm离心分钟取上清于另一新管中加入体积的MNaAcpH混匀加入倍体积无水乙醇轻轻混合rpm离心分钟弃上清加入乙醇ml充分洗涤rpm离心分钟弃上清自然干燥DNA约分钟加入μlTE保存检测浓度及纯度。酚氯仿抽提法外周血反复冻溶破坏红细胞取ml外周血加入mlPBS混匀后rpm离心分钟弃上清加入μlTEpHμlSDSmgml蛋白酶Kμl(终浓度μgml)混匀水浴消化过夜或消化小时加入等体积的饱和酚并充分混匀rpm离心分钟吸取上清液于另一新管中重复上一步骤一次吸取上清液于另一新管中加入等体积的酚氯仿并充分混匀rpm离心分钟吸取上清液于另一新管中加入体积的MNaAcpH混匀后加入倍体积无水乙醇并轻轻混合可见絮状乳白色DNA团块rpm离心分钟弃上清加入乙醇ml充分洗涤rpm离心分钟弃上清自然凉干后加入TE液保存检测浓度及纯度动物组织基因组DNA提取材料生理盐水十二烷基硫酸钠(SDS)三羟甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)饱和酚氯仿异戊醇无水乙醇乙醇蛋白酶KRNase酶手术剪刀、镊子、吸水纸微量取液器研钵、mL离心管、一次性手套、mL离心管架、记号笔试剂配制Tris–HCLmolLPHml配制方法:ml双蒸水g固体Tris放入烧杯中溶解用浓盐酸调PH值到转移到ml容量瓶中加入双蒸水定容摇匀后转到准备好的输液瓶中贴上标签高压灭菌后降至室温保存备用。生理盐水:NaCLml配制方法:在ml双蒸水中溶解g固体NaCL加水定容至ml摇匀后转到准备好的输液瓶中贴上标签高压灭菌后降至室温保存备用。EDTAmolLPHml配制方法:将g的EDTANaHO溶解于ml双蒸水用g的NaOH颗粒(慢慢逐步加入)调PH值到用ml容量瓶定容如果EDTA难溶先加NaOH溶解然后逐步加EDTANaHO。TES缓冲液(释放DNA)ml配制方法:g的mollNaCl溶解于ml双蒸水将在分别加入ml的mollEDTA、ml的TrisHClpH加定容至ml摇匀后转到准备好的输液瓶中贴上标签高压灭菌后降至室温保存备用。SDS(变性剂破细胞壁)ml配制方法:将g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于ml双蒸水于加热溶解用浓HCl调至PH定容至ml摇匀后转到准备好的输液瓶中贴上标签保存备用。蛋白酶K(降解蛋白质):mgmL无菌三蒸水溶解。RNA酶(降解RNA)配制方法:将胰RNA酶(RNA酶A)溶于mmolL的TrisCL(PH)、mmolLNaCL中配成mgml的浓度于加热min缓慢冷却至室温分装成小份存于–。氯仿:异戊醇:ml按:的比例加入氯仿、异戊醇摇匀转到准备好的瓶中贴上标签保存备用。TE缓冲液(溶解DNA)PHml配制方法:将ml的mmolTrisHClPH、ml的mollEDTAPH加入到ml的容量瓶中调PH定容至ml摇匀后转到准备好的瓶中贴上标签高压灭菌后降至室温保存备用。实验操作方法组织块解冻用生理盐水洗去血污剪取约g组织放入ml离心管中剪碎。加入mlTES混匀再加入ulSDS()ul蛋白酶K(mgml)充分混匀后于C保温h每h摇次。放置到室温加入等体积饱和酚(ul)颠倒混匀rm离心m分离水相和有机相小心吸取上层含核酸的水相到一个新的ml离心管。加入等体积酚:氯仿:异戊醇(::)颠倒混匀rm离心分钟取上层转移到新的ml离心管中。加入等体积氯仿:异戊醇(:)颠倒混匀rm离心分钟取上层清液到一个新的ml离心管。加入倍体积的C预冷的无水乙醇沉淀DNA观察现象。rm离心分钟弃乙醇。C保存的乙醇洗涤rm离心分钟去乙醇C干燥DNA。加入适量TE溶解DNA(具体依DNA的多少而定)C保存备用。取新鲜或冰冻动物组织块g(cm)尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中加入ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块转入ml离心管中加入蛋白酶K(ugml)μl混匀。在恒温水浴锅中水浴min也可转入水浴,h间歇振荡离心管数次。于台式离心机以rpm离心min取上清液入另一离心管中。加倍体积异丙醇倒转混匀后可以看见丝状物ul吸头挑出用凉干ulTE用重新溶解。(可进行PCR反应等需要进一步纯化的按下列步骤进行)加等量的酚氯仿异戊醇振荡混匀离心rpmmin。取上层溶液至另一管加入等体积的氯仿异戊醇振荡混匀离心rpmmin。取上层溶液至另一管加入体积的molL乙酸氨加入倍体积的无水乙醇混匀后室温沉淀min离心rpmmin。小心倒掉上清液将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁的残余液滴除掉。用ml乙醇洗涤沉淀物次离心rpmmin。小心倒掉上清液将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁的残余液滴除掉室温干燥。加ulTE重新溶解沉淀物然后置于或C保存备用。植物组织基因组DNA提取CTAB抽提缓冲液在水浴中预热取少量植物组织置于试管中用小杵磨至粉状加入ul的CTAB抽提缓冲液轻轻搅动摇匀置于的水浴槽或恒温箱中每隔min轻轻摇动min后取出冷却min后加入氯仿异戊醇:至满管振荡min使两者混合均匀rpm离心min与此同时将μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中rpm离心min后移液器轻轻地吸取上清夜转入含有异丙醇的离心管内将离心管慢慢上下摇动s使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物rpm离心min后立即倒掉液体注意勿将白色DNA沉淀倒出加入μl的乙醇将DNA洗涤minrpm离心s后立即倒掉液体干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)加入μl×TE缓冲液使DNA溶解置于保存、备用。较为常用的细菌DNA提取方法:实验步骤:、将菌株接种于液体LB培养基震荡培养过夜。、取ml培养物rpm离心min。、沉淀中加入ul的TE缓冲液反复吹打使之重新悬浮加入ulSDS和ul的蛋白酶K混匀于温育h、再加入ulCTABNaCl溶液加入ulmolLNaCl充分混匀混匀后再温育min。、加入等体积的酚氯仿异戊醇混匀离心min将上清转入一只新管中加入倍体积的异丙醇轻轻混合直到DNA沉淀下来沉淀可稍加离心。、沉淀用ml的乙醇洗涤后离心弃乙醇(细菌基因组DNA提取取出ml培养好的细菌培养液rpmmin用TE洗涤后再离心菌体重悬于mlTE溶液。(加入mgml溶菌酶溶液μl(终浓度为μgml)保温min。(加入RNase(mgml)μl至终浓度为μgml然后加入,SDS溶液ml保温min。(加入蛋白酶K(mgml)μl至终浓度为μgml)然后加入保温,min。(加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(::)混匀rpm×min取上清液转入另一离心管中。如此,次即可。(将上清液中加入,体积的醋酸钠倍体积的冷的无水乙醇旋转离心管会出现沉淀物DNA。(,乙醇洗涤一次室温下干燥但勿使DNA完全干燥以便使其易溶。(加入mlTE或双蒸水溶解DNA测定值OD和OD确定DNA含量和纯度。(,保藏。

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