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荧光分光光度法检测组织中的组胺.doc

荧光分光光度法检测组织中的组胺

这个夏天有dian冷
2017-10-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《荧光分光光度法检测组织中的组胺doc》,可适用于综合领域

荧光分光光度法检测组织中的组胺荧光分光光度法检测组织中的组胺第卷第期第页年月华中科技大学(医学版)ActaMedUnivSciTechnolHuazhongVoNoPApr荧光分光光度法检测组织中的组胺*何功浩周四元胡静孟静茹王慧罗晓星第四军医大学药学系药理学教研室,西安摘要目的建立组织中释放组胺的检测方法方法采用邻苯二甲醛(OPA)对组织中释放的组胺(HA)进行衍生,对衍生物进行激发与发射波长扫描采用NaPO沉淀组织液中的干扰离子结果组胺一邻苯二甲醛衍生物的最大激发波长和发射波长分别为am和am,NaPO能够有效地消除Ca抖和Mg对荧光的淬灭作用该法测定组胺的工作曲线回归方程为F一CO,相关系数r一,线性范围为×,×molL,检出限为×molL高,中,低浓度组胺的回收率为,结论该方法可用于检测组织中释放的组胺,无须提取,操作简便,快捷,效果可靠关键词荧光分光光度法组胺邻苯二甲醛中图法分类号RDeterminationofHistamineinTissuesbyFluorometricMethodHeGonghao,ZhouSiyuan,HuJingetalDepartmentofPharmacology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'anAbstractObjectiveToestablishamethodtOdetecthistamine(HA)releasedfromtissuesMethodsC卜Dhthalaldehvde(OPA)wasusedtOderivatizeHAreleasedfromtissuesExcitationandemissionscanwereperformedonthereactionsystemNaPOwasusedtOprecipitateCaandMgResultsTheexcitationmaximaandemissionmaximawerenmandam,respectivelyNaPcoulddiminishtheeffectofCaandMgonthefluorescenceintensityofthereactionsystemTheworkingcurveforHAwasF一Cwiththelinearrangeof×O一一O×一molLandwithcorrelationcoefficientofThedetectionlimitwas×molLTherecoverywasbetween一ConclusionThismethodcanbeemployedtOdetectHAreleasedfromtissueswithoutextractionofHAfromthesampleandiSeasytOoperateKeywordsfluorometryhistamineOphthaIaIdehyde组胺(HA)是机体内具有强生物活性的物质之一,在中枢神经系统,HA作为神经递质介导觉醒和睡眠,认知和记忆等作用在外周组织中,HA主要介导过敏反应及促进胃酸分泌在心肌缺血情况下,大量HA释放还可导致严重心律失常近年来有报道表明HA可能作为一种新的外周交感神经递质而参与调控心血管功能活动因此准确而快速地测定外周神经释放HA,对于阐明神经性HA的生理和病理意义十分重要目前检测生物样品中组胺常用的方法有高效液相色谱法l,酶联免疫法等其中,高效液相色谱法灵敏度较高,但仪器及耗材较为昂贵,且其前处理步骤比较繁琐,需要经过提取后才可衍生进样,提取步骤相对复杂酶联免疫法测定虽然步骤简便,但检测灵敏度较低组织中释放HA的量很低,建立国家自然科学基金资助项目(No)何功浩,男,年生,硕士研究生,助教通讯作者,Correspndingauthor,Tel:,Email:XXluofmmueducn操作简便,灵敏度高的检测方法尤为必要HA本身无荧光,但与邻苯二甲醛(OPA)的缩合产物可发荧光本研究探索了组织液中各离子成分对于HAOPA反应体系荧光强度的影响,建立了一种简便,灵敏,快速的组胺检测方法材料与方法药物与试剂组胺二盐酸盐(HA)(AR,美国Sigma公司)OPA(AR,国药集团化学试剂有限公司)甲醇(AR,西安化学试剂厂)其他试剂均为分析纯所用水均为Millipore去离子水仪器与动物F一荧光分光光度计(日本日立公司)XF一型电生理刺激器(上海医用电子仪器厂)雄性SD大鼠,,g雄性豚鼠,,g雄性小鼠,O,gI衍生化方法配制×lOmolLHA标准溶液,取ml华中科技大学(医学版)年月第卷第期HA,加molLHCml,然后加入molLNaOH溶液ml,混匀后立即加入OPA甲醇溶液ml,混匀置室温下反应min,加mlmolLHCI终止反应所得反应产物置于荧光分光光度计中进行激发和发射波长扫描各离子对产物荧光强度影响检测的组织样本为Krebs液,其中含有NaC,KC,KHPO,NaHCO,CaC,MgC和葡萄糖(Glu)等多种成分具体配方为:NaCmolL,KCN,molL,MgC×,molL,KHPO×molL,NaHCO×一molL,CaCNmolL,GluN一molL为考察其中各离子对于衍生化产物荧光强度的影响,配制组溶液,分别为:只含NaCI含NaC,KC,KHPO和Glu含NaC,KC,KHPO,Glu和NaHCO只含CaC只含MgC含CaC和MgC,各成分浓度与Krebs液相应成分相同,并用其分别配成HA的标准溶液(HA浓度均为×一toolL)各取ml进行缩合反应,分别测定其荧光强度待测样本收集电场刺激啮齿类动物离体输精管是研究交感神经递质释放及功能的常用模型【,本研究利用前述HA检测方法观察电场刺激交感神经末梢对大鼠,豚鼠或小鼠离体输精管标本释放HA的影响将大鼠,豚鼠或小鼠分别脱颈处死,迅速取输精管,清除周围脂肪,血管及结缔组织,置于灌有mlKrebs液的恒温浴槽内,温度,液体中始终通有CO混合气体输精管一端固定于浴槽底部,另一端以丝线悬于张力换能器上,调整组织初始张力为N,N,平衡h,小鼠输精管初始张力调整为N一N其间每分钟更换次灌流液,每次均为ml输精管两侧置对平行金属板电极,电极连于电生理刺激器上,以备电场刺激之用平衡完毕后给予频率为Hz,波宽ms的电场刺激,刺激时间为S刺激完毕立即吸取灌流Krebs液ml,以NaPO预处理后按""所述方法进行荧光测定结果产物的荧光光谱特征HA本身不具有荧光特性,但在碱性条件下与OPA发生缩合反应后生成具有较强荧光特性的产物,产物在酸性条件下稳定该缩合产物的荧光光谱如图所示,其最大激发波长和发射波长分别为l曼oO靛OEX:激发波长扫描EM:发射波长扫描图HA与OPA缩合产物的荧光光谱(HA的浓度为×toolL)组织中金属离子对于产物荧光强度的影响由图可见,Krebs液中Ca和Mg对于体系荧光强度有着很大的抑制作用,在Ca和Mg单独或者同时存在的情况下,体系荧光强度较无Ca和Mg时下降()(一),仅较空白本底略高加入NaPO时可使产物体系荧光强度增强(图)NaHCO对于产物体系荧光强度亦有抑制作用,原因可能与NaHCO影响产物体系PH值有关鳗靛罂:只含NaC:含NaC,KC,KHPO和Glu:含NaCI,KC,KHPO,Glu乖NaHCO:只含CaC:只含MgC:含CaC和MgC:空白本底(不含HA)除外其余各组溶液HA浓度均为O×molL,溶液各离子浓度与Krebs液相应成分相同图组织样品中不同离子对反应体系荧光强度的影响干扰离子的隐蔽加入不同浓度NaPO对于反应体系荧光强度何功浩等荧光分光光度法检测组织中的组胺l氍靛波长(nn):NaP前处理(HA浓度为×molL):无NaPO处理,其余溶液成分均与相同(HA浓度为×molL)图NaPO对于反应体系荧光强度的影响的影响如图所示,可见NaPO可有效去除干扰NaPO浓度不同,同样浓度HA(×molL)所得荧光强度不同当NaPO浓度达到molL时,荧光强度达到最高工作曲线回归方程和检出限在×,×molL范围内,HA的浓度与荧光强度之间有着良好的线性关系,见图检测HA的工作曲线回归方程为F一C(C:×一molL),相关系数r一,检出限为×,molL分析方法的准确度采用回收实验检验本方法的准确度,配制低,高浓度HA(×,,×,,×molL)分别衍生测定荧光强度,结果见表回收率范围在O,之间,表明该方法稳定可靠骥盔NaPO,(molL)图不同浓度NaPO对于反应体系荧光强度的影响(n,HA浓度为×molL)loolll憩表蕾lHA(X一olL)图HA浓度与荧光强度的回归曲线(r=)表检测HA的回收率及精密度实验结果样本分析按照前述方法收集到离体输精管电场刺激后的灌流Krebs液进行样品分析,沉淀处理后测定其荧光值,得到灌流液中HA浓度为:大鼠,(×一×)tool(Lg)(一)豚鼠,(×一×一)tool(Lg)(一)J,鼠,(×一×一)tool(Lg)(一)讨论本实验室前期研究工作表明,HA可能作为一种新的外周交感神经递质u因此迅速而灵敏地检测神经源性HA的释放量有着重要的意义本法耗时短,操作简便,整个衍生过程只需min,同时具备一定的灵敏度将本法用于检测前述不同种属离体组织标本能很好检测其神经源性HA的释放在本实验过程中发现,组织液中的HA与OPA发生衍生反应后,产物荧光强度较弱,不足以达到所需的灵敏度分析了Krebs液中各离子对反应体系荧光强度的影响,发现Ca和Mg对于衍生产物体系荧光强度有很强的抑制作用,而将Ca抖和Mg沉淀后,可使反应产物体系的荧光强度极大增强,从而提高了方法的灵敏度此方法对于临床及实验研究中HA的荧光检测有一定的指导意义'华中科技大学(医学版)年月第卷第期但是,对于Ca抖和Mg淬灭体系荧光的机制尚有待进一步探讨考虑到Ca计和Mg的磷酸盐属难溶物,且NaPO对于体系pH值影响较小,PO离子较为稳定,故选用NaPO作为沉淀剂在对NaPO条件进行优化时,观察到当NaPO浓度达到molL时,反应体系的荧光强度达到最高,但其相应空白本底也较高,其信噪比相对于加入molLNaPO时反而减小,因此,本方法中加入的NaPO浓度定为molL本实验曾考虑使用NaCO作为沉淀剂,但NaCO对于产物体系pH值有一定影响,且NaCO与体系中HC反应可产生气泡,会干扰荧光检测将本检测方法用于离体标本的HA测定,结果表明,大鼠,豚鼠或小鼠输精管交感神经末梢受电场刺激后均能释放HA其中,豚鼠单位质量标本释放HA最多,大鼠最少综上所述,本实验建立了以NaPO沉淀后直接衍生测定组织中HA的方法,并将其用于离体生物标本HA释放量的测定该方法无须提取,灵敏度较高,具有简便,快捷,易于操作的特点参考文献IIMK,IU()XX,CHENIetaColocalizationofhistamineanddopaminebetahydroxylaseinsympatheticganglionandreleaseofhistaminefromcardiacsympatheticterminalsofguineapigJAutonAutacoidPharmacol,,():IIMK,HUJ,CHENZ,etaEvidenceforhistamineasaneurotransmitterinthecardiacsympatheticnervoussystemJAmJPhysiolHeartCircPhysiol,,():H一HPREVIATIM,RASPADRIA,BERTLASIetaDeterminationofhistamineinthewholebloodofcoloncancerpatientsJJChromatogrBAnalTechnolBiomedLifeSci,,():HANXQ,V()HRAMMAsensitivemethodforsimultaneOUSdeterminationofhistamineandnoradrenalinewithhighperformanceliquidchromatographyelectrochemistryJJPharmacolMethods,,():OMINEK,JACOBSONKAKIRKKIetaSimultaneousdeterminationofhistamineandNtaumethylhistaminewithhighperformanceliquidchromatographyusingelectrochemicaldetectionJAnalBiochem,,():AYGUNO,SCHNEIDERESCHEUERRetaComparisonofEISAandHPLCforthedeterminationofhistamineincheeseJJAgricFoodChem,,():JACKSNVM,CUNNANETCNeurotransmitterreleasemechanismsinsympatheticneurons:past'present,andfutureperspectivesJNeurochemRes,,():(一O收稿)期刊文摘轴突导向因子netrinl在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与胎盘新生血管形成的关系杨昀,邹丽,徐可树中华妇产科杂志,,():,探讨轴突导向因子netrin一在子嫡前期孕妇胎盘组织中的表达及其对胎盘新生血管形成的作用采用RTPCR和免疫印迹技术,分别检测正常妊娠妇女O例(正常妊娠组)和子痫前期孕妇O例(子痫前期组,其中轻度例,重度例)的胎盘组织中轴突导向因子netrin一mRNA和蛋白的表达采用免疫组化并通过抗F因子抗体检测两组孕妇胎盘组织中的血管密度结果,()正常妊娠组及子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin一mRNA相对吸光度(A)值分别为()和(),netrin一蛋白A值分别为()和(),两组分别比较,差异有统计学意义(P)子痫前期组轻度和重度孕妇netrin一mRNAA值分别为()和(),netrin蛋白A值分别为()和(O),两者分别比较,差异有统计学意义(P)()子痫前期组孕妇胎盘血管密度为()个,正常妊娠组孕妇为()个,两组比较,差异有统计学意义(P)子痫前期组中重度孕妇血管密度为()个,轻度孕妇为()个,两者比较,差异有统计学意义(P)()正常妊娠组孕妇胎盘组织中netrin一mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,相关系数(r)分别为和(P均O)子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin一mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为和(P均O)子痫前期组轻度孕妇胎盘组织中netrinmRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为和(P均O),重度孕妇胎盘组织中netrinmRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为和(P均O)提示子痫前期孕妇胎盘组织中netrin一表达下降,可能是胎盘血管密度降低的原因之一

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