瓢虫的16SrDNA序列扩增_cropped

瓢虫的16SrDNA序列扩增_cropped () 贵州师范大学学报 自然科学版第 21 卷 第 2 期 Vol . 21 . No . 2 ( ) May 2003 2003 年 5 月 Jo ur nal of Guizho u No r mal U niversity Nat ural Sciences () 文章编号 :1004 —5570 200302 - 0052 - 03 Ξ 瓢虫的 16 SrDNA 序列扩增 1 2 龙 健,庞虹 ()1 . 贵州师范大学 生物科学技术系 ,贵州 贵阳 550001 ;2 . 中山大学 生物防治国家重点实验室 ,广东 广州 510275 摘要 :提取酒精浸泡六斑月瓢虫标本的 DNA ,探讨酒精浸泡鞘翅目瓢虫科昆虫标本的核酸的提取方法 ,对提取 得到的核酸进行 PCR 扩增 ,得到 500bp 大小的 16 SrDNA 片段 ,确定这一方法提取的核酸进行 PCR 反应时的循 环参数 。 关 键 词 :六斑月瓢虫 ;核酸 ; PCR 反应 ;分子系统学 中图分类号 :Q969148 文献标识码 :A PCR in 16SrD NA of Coleopte ra cocci nel l i d ae 1 2 L ON G J ian, PAN G Ho ng (1 . Depart ment of Biological Science and Technology , Guizhou Normal U niversity , Guiyang , Guizhou 550001 ,China ; )2 . State Key L aboratory for Biological Co nt rol ,Sun Yat - sen U niversity , Guangzhou , Guangdo ng 510275 ,China Abstract : The DNA of t he alco hol - soaked Coleopte ra cocci nel l i d ae specimen was abst racted. 16 SrDNA f ragment , w hich is abo ut 500bp ,is amplified using PCR. This experiment focuses o n t he nucleic acid abst ractio n met ho d of t he alco hol - soaked Coleopte ra cocci nel l i d ae specimen and t he de2 ter minatio n of t he cycle parameter in t he PCR. The experiment result s in cocci nel l i d ae are satisf ac2 to ry as expected and offer so me reference fo r t he research of molecule systematic research . ( ) Key words : M enochi l us sex m acul at a Fabrici us ; nucleic acid ; PCR molecule systematic research 分类性状受到关注 。生物个体的多态性是由控制 这些性状的基因的多态性造成 ,分子序列的信息代 0 引言 表遗传本质 ,它部受环境影响 ,不受标本个体发育 传统的分类研究工作中存在着不可忽略的局 状况和环境条件影响 ;在不同的类群间有较好的可 限性 ,物种间可供比较的形态学性状有限 ,进化跨 比性 ,是一种理想的共同尺度 ,能够提供充分的可 度较远的类群难以统一分析 ;不同类群的物种可能 ; 能够反映生物进化的机理 。 定量测度的进化信息 聚合 酶 链 式 反 应 , 即 PCR 技 术 , 能 特 异 的 扩 增 表现出相似的形态特征 ;用形态特征定义一个分类 ( ) 介元 ,就必须对标本的完整性有严格的要求 ;此外 , DNA 链上的某一片段 由两端的引物确定,得到 对形态特征的选取和描述也会有人为的影响 。目 染色体上特定位置的 DNA 片段 ,对这些片段进行 5 ,6 前 ,随着分子生物学科的发展 ,多学科 、多层次的理 分析 ,了解该基因组的特征。 论和技术手段不断的融入传统分类学 ,分子水平的 1998 年王瑛等人应用 PCR 技术分析了鳞翅 第 2 期 龙 健 ,庞 虹 :瓢虫的 16 SrDNA 序列扩增 目棉铃虫 Hel icove r p ra a r m i ge ra 18 SrDNA 的全序 离心 管 , 加 入 0 . 5 mL 碾 磨 液 , 50 度 水 浴 15 h , 列 ,将该序列与鞘翅目 ,膜翅目 、同翅目 、双翅目 、捻 14 000 ×g 离 心 30 min , 取 上 清 液 。加 入 等 体 积 翅目和弹尾目各一昆虫的同源保守区进行了比较 , 酚 ,氯仿及异丙醇混合液 ,手摇 10 min ,14 000 ×g 得出的实验结果支持了有关捻翅目属于一个独立 离心 30 min , 取上清液 。加入等体积氯仿及异丙 2 ( ) 的目级分类阶元的论点。杨效文等人 1998 年醇混合液 ,手摇 10 min ,14 000 ×g 离心 30 min ,取 用 RA PD —PCR 技 术 研 究 了 我 国 烟 草 上 烟 蚜 上清液 。加入等 1 倍体积 3M ,p H = 5 . 2 醋酸溶液 ( ) M y z us pe rsicae S ul ze r的种群分化 ,结果表明 :我 及 2 体积无水乙醇 ,混均 ,浸于冰水混合物中 3 h 。14 国烟蚜的不同地理种群和不同体色之间 DNA 均 000 ×g 离心 10 min ,使 DNA 沉淀 ,去上清。加 70 %酒 1 μ呈现多态性 ,且不同的引物可在不同水平上反应出 精清洗沉淀物 ,吸干 ,风干。加 150l TE 保存。 4 μ 取 5 L 保存液 , 稀释 1 . 2 . 2 样品浓度的测量 烟 蚜 种 群 的 DNA 多 态 性。Zakharov E. V . ( ) 2000 年利用 RA PD - DNA 多态性分析技术对稀 100 倍 ,测 OD 值 。通过 OD的比值计算 DNA 260/ 280 ( ) 少的 燕 尾 蝴 蝶 s w al l oet ai l bu t te rf l y 进 行 了 研 样品的纯度 。 8 究, Zakharov E. V . , G. N . Chelo mina ,and Yu. N . 表 1 样品 OD 值测量及计算结果 ) (Zhuravlev 1999 年用 RA PD 技术成功分析了保存 OD0 . 072 0 . 075 0 . 078 0 . 079 0 . 080 260 7 最高达 5 年蝴蝶标本。OD 0 . 040 0 . 042 0 . 046 0 . 046 0 . 046 280 OD1 . 80 1 . 79 1 . 70 1 . 72 1 . 74 260/ 280 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 从 表 1 可 知 所 提 取 的 DNA 纯 度 较 好 , 无 杂 1 . 1 实验材料 质 ,较为完整 。样品浓度 = OD×稀释倍数 ×50/260 酒精浸泡标本 —六斑月瓢虫 M enochi l us sex 2 ) (μμ1 000 g/ uL 计算结果为 0 . 390g/ gL 。 ( ) m acul at a Fabrici us nuc , 1999 年 10 月 27 日 至 1 . 2 . 3 PCR 扩增 16 SrDNA 引物为 : 11 月 3 日 ,庞虹采自广东内伶仃岛 。 CPE418 - 01 : 5’- CGCCTGTTGATCCTGVVA G - 3’ 1 . 2 实验方法 CPE418 - 02 :5’- CCGGTCTGAACTCA GATCACGT - 3’ 1 . 2 . 1 DNA 的提取 取虫体约 0 . 1 g 于 1 . 5 mL 表 2 PCR 反应体系 D HO Tube Mgcl 缓冲液 DN T Ps 引物 1 引物 2 Taq 酶 DNA 总体积 DNA 浓度 2 1 1 . 5 2 . 5 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 17 . 25 0 . 85 25 0 . 013 2 1 . 5 2 . 5 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 17 . 30 0 . 80 25 0 . 012 3 1 . 5 5 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 17 . 20 0 . 90 25 0 . 014 4 1 . 5 2 . 5 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 17 . 15 0 . 95 25 0 . 015 5 1 . 5 2 . 5 2 0 . 2 0 . 2 0 . 5 18 . 1 0 25 0 μ1 . 2 . 3 . 1 在 200L 的离心管中加入上述成分 。 定了从生物个体的遗传本质着手 ,利用分子信息进 1 . 2 . 3 . 2 将离心管置于 PCR 仪 ,于 94 ?加热 20 行分类研究的可行性 。并为其他瓢虫和小型昆虫 ) ( s ,然后按下列程序反应 : 94 ?40 s 变性50 ? 40 s 的鉴定提供参考 。但是 ,由于昆虫个体本身具有差 () ) ( 退火72 ?40 s 延 伸34 个 循 环 后 , 72 延 续 10 异 ,加上制成酒精浸泡标本后因时间的长短不同 , min ,产物保存于 4 ?。 浸泡用酒精的浓度不同 ,差异增大 ,目前还无法找 μ1 . 2 . 4 将扩增产物各取 5 L 用凝胶电泳检测并 到一个完全适用于所有昆虫标本的核酸提取条件 通过紫外扫描得到图 3 。 和步骤 。理论上 ,对于不同保存条件下的昆虫标本 的核酸的提取 , 也不可能有一个统一的方法和条 2 结果和讨论 件 ,只能通过在大体相同的条件下各自摸索 ,找到 2 . 1 核酸的提取 大同小异的具体条件 。 ( 2 . 2 核酸的扩增六斑月瓢虫 M enochi l us sex m acul at a Fabri2 ( ) 扩增结果得到大小 500bp 的 DNA 片段 见图ci us是分布十分广泛的捕食性瓢虫 ,色班变异大 , ) 1 中的 A ,B,真核 rDNA 多拷贝重复片段协同进 易取材 ,是理想的实验材料 。本研究所用的六斑月 () 第 21 卷 贵州师范大学学报 自然科学版 ( ) D rosop hi l i d ae Desalle , 1992 , 萤 科 Ca n t hstoi dea ( ) H. Suzuki , 1997等不同 种 类 昆 虫 高 级 阶 元 的 研 究 。 参考文献 : 1 张迎春 ,郑哲民. 瓢虫 DNA 的提取研究 J . 陕西师范 () () 大学学报 自然科学版,1999 ,27 1:92294 . 王瑛 ,陈晓峰 . 棉铃虫 18 S 核糖体 RNA 基因的序列分 2 () 析及分子系统学 J . 昆虫学报 ,1999 ,42 3:2422247 . 刘 伟 , 王 瑛 . rDNA 在 昆 虫 纲 系 统 发 育 研 究 中 的 应 用 3 () J . 昆虫知识 ,1998 ,35 2:1232126 . 杨效文 ,张孝羲 . 我国烟蚜种群分化的 RA PD 分析 J . () 昆虫学报 ,1999 ,42 4:3722380 . 4 伍新尧 . 分子遗传学与基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 M . 郑州 : 河南医科 大学出版社 ,1987 . 78290 . 5 吴乃虎 . 基因工程原理 M . 北京 : 科学出版社 , 1992 . 2032233 . 6 E. V . Zakharov , G. N . Chelo mia , and Yu. N . Zhuravlev. 图 1 引物 CP E42081 ,CP E42802 的 PCR 扩增结果 Islatio n and Analysis of DNA f ro m Museum Specimens of 7 A - F —六斑月瓢虫 ,M —DNA Mar ker( ) But terfies L epidop tera , Papilio nidae wit h t he Aid of 是间隔区长度的差异 。这给我们带来了研究上的 Polymerase Chain Reactio n U sing Arbit rary and U niversal 便利 。PCR 时采用对 16 SrDNA 进 行 扩 增 , rDNA Gene - Specific PrimersJ . Russian Journal of Gemetics , 具有多变区和保守区 ,能够反映早期进化事件 ,目 () 2000 ,36 9:101721024 . Zakharov E. V . Estimate of genetic polymorp hism , mor2 前利用保守区在高级分类阶元关系的研究中应用 p hological variability and co nservatio n of artop haneura al2 较广 。线粒体 16rDNA 具有保守性 ,适于高级分类 8 ( ) cinous lepidop tera , papilio nidae in p rimorye J . 阶元和边缘物种关系的分析 ,以及推断早期的进化 Biodicersity and dynamics of ecosustems in nort h Eurasia . 3 事件。近年 ,16rDNA 序列已被广泛应用于不同 2000 ,1322134 . () 种 类 昆 虫 如 寄 生 蜂 Derr et al . ,1992,果 蝇