[word] 人OX40L在BL-21大肠杆菌中的表达和生物学功能研究

[word] 人OX40L在BL-21大肠杆菌中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达和生物学功能研究 人OX40L在BL-21大肠杆菌中的表达和生 物学功能研究 施勤等人OX40L在BL-21大肠杆菌中的表达和生物学功能笠翅 ? 分子与细胞免疫学? 人OX40L在BL.21大肠杆菌中的表达和生物学功能研究? 施勤陈永井孙建军马泓冰姜智毛一香张学光 (苏州大学医学生物技术研究所,苏州215007) 中国图 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 分类号R392.11文献标识码A文章编号looo-4s4x(2oos)o3-o1~-06 [摘要]目的:克隆和表达人可溶性OX40L重组蛋白(L),探讨OX40L信号在T细胞 对乳腺癌细胞反应中的协同 刺激效应. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :运用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组融合蛋白 GL,Westernblot分析表达蛋白的特异性;采 用体外T细胞和乳腺癌细胞混合培养体系,观察对T细胞生长和增殖的影响.结果: 构建了GST-sOX40L原核表达体系,从而 进行重组蛋白的有效表达;纯化的重组蛋白通过免疫印迹分析能被特异性单抗识 别,并在体外培养体系中显示出协同刺激T 细胞对乳腺肿瘤细胞的反应性:促进T细胞生长,增殖以及IL-2的分泌.结论:成功 地研制了具有生物学活性的sOX40L,为体 外激发肿瘤特异性T细胞提供良好的物质基础. [关键词]OX40L;BL-21大肠杆菌;表达;生物学功能 ExpressionofhumanOX40LinBL21E.coliandstudiesonitsbiologicalfunction SHIQin,CHENYong-Jing,SUNJian-Jun,MAHong-Bing,JL4NGZhi,MAOYi-Xiang,Z HANGXue-C.~ng. St~touUniversityMedicalBiotechnologyInstitute,Suzhou215~7,China [Abstract]Objective:TocloneandexpresshumansolubleOX40LinBL-21E.oolitoinvestig atethecostimulateeffectofOX40sisal tothebiologicalactivityofTcoilsculturedwithbreasttumorcellinvitro.Methods:DNAfrag mentencodingOX40Lwasobtainedfromtotal RNAofhumanmatureDendriticcellsbyrever~-transcriptasep0lyIne艘 chainreaction(RT-PCR).ThecDNAfragmentencodinge,xtra-collu— lardomainofOX40LWasclonedintoGSTfusionproteinexpressionvectorpGEX一 5X-3byendonucleasedigesting.ThefusionproteinGST- s0lX4oLWasexpressedandpurifiedstepbystepaccordingtomanufactory'Sprotocolandver ifiedbyWesternBlottingmethod.1heeffectofthis humanrecombinantproteintothebiologicalactivityofTcellsWasinvestigateby3H— TdRincorporationmethodand17JJSA.Results:Thehuman recombinantproteinGST-sOX40LWasverifiedspeciallybyWesternBlottingmethodandc ouldpromoteTcellproliferationandIL-2secretion culturedwitl1breasttulnorcellinvitro.Conclusion:ThefusionproteinWflSexpressedsucce ssfullyandfunctiona1.Itprovidedaneffectiveway tostimulatetumorspecificTcellinvitro. [Keywords]OX40L;BL-21E.co/i;Expression;Biologicalfunction 人OX40配体(Ox4oL/cDl34L)基因1991年由 Miura等克隆,编码183个氨基酸,分子量约34,4o kI),属TNF家族成员,为?型跨膜糖蛋白;主要表达 于成熟DC,活化的B细胞,血管内皮细胞(EVc),脐 带静脉血管内皮细胞(HUEVc),巨噬细胞以及某些 组织器官包括心,骨骼肌,睾丸和肺.其受体OX40, 属TNF受体超家族,为I型跨膜糖蛋白,分子量约 为485OkD.人OX40主要表达于活化CD4,部 分CD8T细胞及成人T细胞白血病细胞(ArI'L)和人 肌IV—I病毒感染的建株T细胞HuT102和MT-2. OX40/OX40L是机体免疫应答过程中一对重要的共 刺激分子,参与机体T细胞分化,T-DC,T-B以及T ?本课题受国家"973"研究项目(2001CB510003)江苏省"135"重点医 学实验室基金和国防科工委重点项目基金资助 作者简介:施勤(1971年一),女,博士研究生,主要从事肿瘤免疫; 通信作者:张学光(1952年一),教授,博士生导师. 细胞的移行和重新分布中,在机体的特异性免疫应 答中起着重要的作用.肿瘤特异性OX40T在有效 识别自身肿瘤抗原的基础上,通过OX40/OX40L信 号进一步增强T细胞的功能,延长细胞存活期,提高 T细胞识别MHC?分子的能力,同时产生多种细胞 因子活化CD8细胞,NK细胞和/或巨噬细胞等,多 途径地发挥抗肿瘤效应uJ. 本实验旨在通过表达OX40L的胞外段活性区, 获得重组融合蛋白GST-sOX40L,体外分析其在肿瘤 细胞,T细胞共培养时对T细胞的协同刺激作用. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1质粒,菌株宿主菌BL-21,质粒pGEX-5X- 3,pBluescfipt由复旦大学黄伟达教授惠赠,并在本实 验室中保存.pUCm-T-Vector克隆质粒购自日本Ta一 Ra生物工程有限公司. 1.1.2酶及其他试剂Trizol由美国GIBICOL公司 提供;T4DNA连接酶购自美国Promega公司;所有限 制性内切酶及RT.PCR试剂盒均购自日本Takara生 物技术公司;X—gal,IPTG,胶回收试剂盒,PCR产物纯 化试剂盒和质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程 有限公司;Tryptone和YeastExtract购自美国Oxfoid 公司;碱性磷酸酶显色法Westernblot试剂盒购自 BoeheingerMannheim公司;鼠抗人OX40L单抗购自 晶美公司;IL-2ELISA试剂盒购自深圳达科为公 司;H.TdR购自北京原子能研究院,G液闪计数仪为 日本津岛公司产品. 1.2方法 1.2.1OX40LcDNA的扩增和克隆 1.2.1.1引物设计合成按GenBank中人OX40L 的cDNA序列设计引物,于编码OX40L全长cDNA 的5和3端设计一对引物Pl,P2和编码胞外段cD. NA的引物P3,P4; P1:5'-ATGGAAAGGGTCCAACCCCTG-3; P2:5'-AAGC-TIEFAGMEAAAGGACACAC,AAI'IV~CC.3: P3:5.GACl(:C他AACCACAC(]ACI?j(D[1CC.3; P4:5'-AGC陬rCxX:IIX(Ai)【:I一3,. 1.2.1.2人外周血树突状细胞(DendriticceHs)的体 外诱导取正常志愿者外周血100ml,经Ficol1分离 获得单个核细胞,按3×106ml接种至6孑L培养板 (2ml/孑L)中,5%CO,37cc培养2小时,轻轻吸出悬 浮细胞,加入含GM.CSF(100ng/na),?,4(50ng/na) 和10%FCS的RPMI1640完全培养基,5%CO2,37cc 培养,3天换液1次.在培养的第8天用常规方法 收集细胞,抽提总RNA备用. 1.2.1.3RT-PCR扩增OX40LcDNA总RNA的抽 提按Trizol试剂盒说明书进行,逆转录为cDNA,以 此为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,以Pl,P2为上下游引物扩增OX40L的 cDNA片段.PCR条件为:变性94cc,3O秒,复性 55cc,3O秒,延伸72cc,1分钟,3O个循环;最后72cc 延伸5分钟. 1.2.1.4克隆载体的构建和测序分析扩增出的 OX40L基因产物经纯化后,用T4DNA连接酶与 pUCm.T.Vector载体16~C过夜连接,连接产物用CaC12 法转化Topl0大肠杆菌,用x.gal和WIG进行蓝白 斑筛选;阳性重组子经PCR,限制性内切酶反应和 DNA测序等方法证实(由上海博亚生物技术有限公 司进行DNA全自动序列分析).将证实后的阳性克 隆在LB培养基(含Amp)中大量扩增,碱法抽提 中国免疫学杂志2OO5年第21卷 pUCm.T.Vector-OX40L重组质粒. 1.2.2人重组OX40L在大肠杆菌中的诱导表达 1.2.2.1可溶性OX40L的扩增和重组表达载体的 构建OX40L是一?型跨膜糖蛋白,氨基末端1, 43aa位于细胞内和跨膜段,44,183为胞外段;我们 以pUCm.T.OX40L质粒为模板,以P3,P4为引物扩 增编码OX40L胞外段(sOX40L)的基因,同法克隆到 pUCm.T-Vector,经BamH工和Hind111双酶切,连入经 相同酶切的pBluescriptSK质粒,CaC12法转化TOPIO 大肠杆菌;阳性重组子经PCR,限制性内切酶反应及 将阳性克隆(pBlu~cfiptSK.sOX4OL)在 测序证实. LB培养基(含Amp)中大量扩增,SDS碱裂解法制备 pBluescriptSK—OX40L质粒.再将pBluescriptSK— sOX40L行BamH工和Sal工双酶切,酶切产物(该产 物正好为OX40L胞外段)装入经相同酶切的pGEX一 5X.3质粒,CaC12法转化TOP10大肠杆菌,阳性重组 子(pGEX.5X.3.sOX40L)经PCR,限制性内切酶反应 证实.在LB培养基(含Amp)中大量扩增,抽提质 粒,CaC1,法转化大肠杆菌BL-21,经PCR和限制性 内切酶反应证实,见图1. 1.2.2.2sOX40L在大肠杆菌中的诱导表达挑取 pGEX.5X.3.sOX40L阳性菌落接种于2mlLB培养液 (添加1%葡萄糖,氨青霉素100r~g/m1),37cc振荡培 养过夜,次Et将过夜菌液按1:100比例稀释扩大培 养,当菌液OD值达0.6,0.8时,加入IFrG至终浓 度1mmol/L培养,诱导表达人重组融合蛋白GST- sOX40L,分别搜集不同培养时间下的菌体,初步分 析GST.sOX40L表达产量,以确定较适宜的诱导条 件. OX40L重组蛋白的分离纯化 1.2.2.3s 1.2.2.3.1sOX40L包涵体的提取,变性,复性及纯 化收集表达GST-sOX40L融合蛋白的菌体,经冻融 后每克湿重加入5ml细菌裂解液(50mmol/LTris. HC1,pH8.0,1nm~I/LEDTA,1nm~I/LDTI",1mmol/L PMSF),经超声波充分破碎后,离心弃上清,分离包 涵体,再用洗涤液洗涤杂蛋白2次(1mol/L尿素和 O.5%Tfi~n.xl0o),离心后的沉淀溶于变性液(6mol/ LGu?HC1,50mmol/LTfis—HC1,1mmol/LEDTA,2 mmol/LD1Tr)中,然后进行复性(2mmol/LGSH,0.2 mmol/LGSSG,1mmol/LEDTA,50mmol/LTris.HC1 pH8.O).复性48小时后将此混合溶液装入透析袋, 浸入lO倍体积的透析液(1×PBS,140mn~l/LNaC1, 1.8mmol/LKH2PO4,2.7mmol/LKC1,10mmol/L Na2HPO4),搅拌透析4小时.移去透析液,最后在 施勤等人OX40L在B[~21大肠杆菌中的表达和生物学功能研究第3期 10倍体积的透析液中透析24小时,换液3次. 10000r/rain离心,收取上清.上清用0.22j?n滤器 过滤后上柱纯化. 1.2.2.3.2亲和层析分离,纯化目的蛋白复性后 的GST.sOX40L融合蛋白经20mmolPBS(pn7.3)缓 冲液充分透析后,以0.5ml/min流速上GSTrap柱 (购自Pharmacia公司).最后用洗脱液(50mmol/L Tris.HC1,10mmol/Lreducedglutathione,pH8.0)进行洗 脱,流速1.0ml/min.收集冼脱峰,作SDS.PAGE电 泳,同时用IDRRY法对获得的蛋白定量. 1.2.2.3.3Westernblot分析实验操作参考试剂 盒说明书进行,SDS.PAGE结束后,将电泳凝胶作适 当修整,切取相等大小的3mol/L滤纸和硝酸纤维 膜,按正确顺序叠放后,进行免疫印迹.硝酸纤维膜 用试剂盒提供的封闭液,4?过夜.次日加入鼠抗人 OX40L单抗,室温孵育1小时,用TBST洗去未结合 的抗体,加入AP标记的羊抗鼠抗体,室温孵育1小 时,同上用TBST洗去未结合的抗体,洗涤20分钟后 加入底物,显色. 1.2.3GsT.s0x40L融合蛋白对T细胞增殖的影响 1.2.3.1H.TdR掺人法检测T细胞增殖经Ficol1 分离健康供血者的外周血,贴壁培养过夜,轻吸悬浮 细胞,经磁珠分选获得纯度>90%的T细胞.在获 得GST.sOX40L融合蛋白的基础上,96孔板激发型 抗CD3单抗包被过夜(0.5t,eCr~),每孔按乳腺癌细 胞MDA.MB-435(经丝裂霉素处理)I×103,T细胞 1×105设6个实验组:T细胞;T细胞+GST-sOX40L (10t~g/m1);T细胞+GsT(10tc,/m1);T细胞+MDA. MB—435;T细胞+MDA.MB-435+GST.sOX40L(10g/ m1);T细胞+MDA.MB-435+GST(10t,g/~),每组设 3个复孔,作用3天后倒置显微镜下观察T细胞生 长情况,同时在培养的最后16小时加入H.TdR, 3.7×lO'Bq/~h,收集细胞,经l3液体闪烁计数仪测 定cpm值. 1.2.3.2ELISA方法检测IL-2的分泌在上述实 验基础上,在第3天收集各实验组细胞上清,按照 IL-2ELISA试剂盒说明书操作,检测细胞培养上清 中IL2的含量. 图1pGEX-SX-3-sOX40L表达载体的构建 F.1ConductionofpGEX一5X一3一sOX40Lexpressionvector - 166? 2结果 2.1重组表达载体pGDr-5x.3sOX40L的构建及鉴 定OX40L基因位于人染色体的l啦5,编码区eDNA 全长549bp,采用RT-PCR方法从Dc中用P1,P2引 物扩增出的OX40L目的基因,酶切,序列 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 进一 步证实.经PCR,酶切,连接等步骤将编码OX40L 胞外段DNA片段插入pGEx.5x.3载体,阳性重组质 粒经双酶切鉴定(Bm】I{I和SalI)及PCR鉴定均可 产生417b口的特异性目的片段,见图2. 2.2GST-sOX40融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表 达和分离纯化r-s0x加L融合蛋白的表达系统 在1mmom/L矸G和37?条件下,诱导6小时,产生 以包涵体为主的GST-sOX40L融合蛋白,GST分子量 约为26kD,soX加盼子量约为20kD左右,SDS-PAGE bp 2000 10呻 750 500 250 l帅 图2pGEX-S'K-3-sOX40L质杖酶切,PCR鉴定的电泳结果 Hg.2Ide,lflffzafionofpGEX-$X-3-sOX40L目premvedor Note:1.5.DL2000DNAmmke~;2.Produ~cnpUCm-T-VeO~r-OX40L— g吲出B?nHI肼dsBII朗d咄d耻;3.pcEX-SX?3?80X40L expwsdmveet~;4.PCRpumOX40L. 围3大肠杆菌诱导后的菌体蛋白SI~-PAGE的电泳结果 T.3~DS-PAGEofGST-sOX40Lapr蝴inBL21 N咖:I_L瑚Tk0fp血但.3.hI?totalb?苣j呐如(dif帅l bk^d?塌);4.Un~nduced佃'db?n. 电泳图在45kD左右有一蛋白带,与预期大小相符. 变性和复性后,经SDS-PAGE电泳和Westernblot证 实,见图3—6. 2.3Gsr.L融合蛋白对T细胞增殖的刺激作 用实验第3天,倒置显微镜镜下可见,6个实验组 中的T细胞均有不同程度的T细胞活化,其中T细 胞+MDA.MB-435+GST-sOX40L实验组T细胞聚集 成团现象明显.成团直径较大,成团细胞数量较 围4GST-sOX40L亲和层折纯化 F.4The一Ijedl~otlofGST-sOX40Lwomntitter ammtydwmmgrap~ kD 66 45 36 29 24 图5大肠杆菌诱导后的菌体蛋自及纯化后目的蛋白SDS- PAGE的电泳结果 ng.5SDS-PAGEofGST-sOX40Lpr一InB[2Iandpu- driedprot~ :1.Inducedtor,alhecte~.pto~in;2.Purif~dpr~ein. 圈6Westemblet分析GST-sOX40L蛋白 . 6Westernblot柚由盎ofapr0dIl吐I棚0fG sOX40L Note:1,2.GSD.0X40Lp-口II;3,4.Csrpr嘶n- 咖瑚葶}瑚瑚 ? m拈;5}N"? _??B:T~MDA.MB-43.~-GSTC:T+MDA-MB-435+GST—soX40L 圈7G盯.s040L融合蚤白对T细胞的增殖的影响 F.7Effectefs0x加Lprotein?theprdlfevation0fTcellwith??pe Note:A.T+MDAoMB.435;BT+MDA.M1~-435+Gsr;cT+MDA-MI~435+GST-sOX40 L 250oo 200OO l5000 ul00O0 S伽0 0 10O0 900 刚l0 700 600 f,00 400 300 200 100 0 ._鲁 l差 !兰 E 望 宝 0 ?着 8 图8Gs0r栅L融合蛋白对T细胞的增殖的影响图96s0lx蚰L融台蛋白对分泌的 影响 . 8EffectofGST-sOX48Lpcoteinonthepvetlferafi~oftFig-9EffectGST-sOX40L? thesecretionofIL-2 cegwabH-TdRIn?qmd?methedbyELtSA 多.H-TdR法检测结果显示,该实验组对T细胞的 增殖活化作用最强,培养上清IL-2的含量最高,与 其它实验组相比+有显着性差异(P<O.05),见图 7—9. 3讨论 OX40L是?型跨膜糖蛋白,属TNF家族.目 前,国内尚无开展可溶性OX40L的研究报道.因 此.采用基因工程的方法生产具有天然生物学活性 的人0X40L重组蛋白,将为研究这对共刺激分子提 供有价值的物质基础.大肠杆菌表达系统是目前常 用的表达系统之一,其低廉的表达成本和较高的表 达产量是任何其他系统所难以比拟的.已有TM' 在大肠杆菌中的成功表达的报道.本研究pGEX 5X-3为载体,以获得具有生物学活性的OX40L可溶 性蛋白.. 用于大肠杆菌表达的载体很多.其中pGEX表 达载体是目前最常用的表达载体,pGZX载体能使目 的基因以c,sr融合蛋白的方式在大肠杆菌宿主菌 中高水平表达.GST融合蛋白可通过商品化的GST 亲和层析柱进行纯化.GST与目的蛋白之间有一段 柔性肽相连,使目的蛋白的空间结构不受相邻Gsr 蛋白的影响,柔性肽中含有特异的酶切位点,通过特 异性的蛋白酶将C,ST去除.在低浓度IPrG诱导下, 可使融合蛋白以可溶性的方式在太肠杆菌中诱导表 达.从而避免了繁杂的包涵体复性过程.与真核细 胞表达系统相比,大肠杆菌表达体系的主要缺点在 于不能使目的蛋白糖基化.但对TNF家族成员及 CD~/B7家族成员研究表明,糖基化对其生物学活 性没有影响.在融合蛋白的表达中,本实验诱导出 可溶性的蛋白,但因为表达量极低和时间的关系,本 实验还是采用了通过诱导包涵体的形式表达.蛋白 经变性,复性和分离纯化后SDS-PAGE电泳和West- emblot证实在BL-21大肠杆菌中表达重组蛋白为 GST-sOX40L目的蛋白. (下转第171页) 鹭t..日至_v凸=+J广 张伟等骨髓间充质干细胞通过分泌TGF-~I抑制T细胞的增殖第3期 胞的影响发挥其免疫调节作用,而且对T淋巴细胞 也有一定的影响,TGF—B1可抑制T细胞的活化与扩 增,参与多种生物过程,包括维持免疫稳态和诱导自 身耐受'].我们观察了是否TGF—B1参与MSCs的 免疫抑制作用.我们的研究结果显示骨髓问充质干 细胞的上清抑制PHA刺激的T淋巴细胞的增殖,抑 制PHA活化的T淋巴细胞IFN一7的分泌,而IFN一7 是活化的Th0分泌的细胞因子,促进Th0向Th1分 化.此外我们应用了抗TGF—B1抗体封闭MSCs上 清,结果显示MSCs上清对PHA刺激的T细胞增殖 的抑制作用能够被TGF—B1抗体部分逆转,由此我们 可以推论TGF-81在MSCs的免疫抑制中起着一定的 作用. 4参考文献 1PittengerMF.MackayAM.BeckSCel.Mulfilineagepotentialof adulthumanmesenchymalstemcellsEJ].Science,1999;284:143. 2BartholomewA,SturgeonC,SiatskasMela1.Mesenchymalstemcells suppresslyr~hocyteproliferationinvitroandprolongskinsurvivalin vlvoEJ].ExpHematol,2002;30:42. 3NicolaMD,Carlo-stellaC,MaMel.Humanbonema/Towstromal cellssuppressT-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspeeif- icmitogenicstimuli[J].Blood,2002;99:3838. (上接第167页) 在体外对T细胞初步的研究表明,GST-sOX4』)L融合 蛋白具有一定的生物学活性,可促进肿瘤细胞对T 细胞的增殖,提高IL-2的分泌,有利于T细胞免疫 应答的进程.OX40/OX40L信号活化T细胞促进 CD4T细胞克隆增生,增强细胞效应功能,在炎症 因子作用下延长细胞存活期,促进效应T细胞数目 增加,是维持APC.T细胞之间的晚期阶段效应的重 要组成成份L2J.有文献报道,OX40L配基化可促进 细胞周期的进行,聚集分裂后的细胞数量增加,延长 抗原特异性细胞(Ag-specificcells)的生存J.在小 鼠的多种肿瘤模型中,包括肉瘤,乳腺癌,肠癌,神经 胶质瘤和黑色素瘤等运用OX40/OX40L策略获得成 功,尽管这些动物模型的肿瘤细胞是MHCII阴性 的,但OX40信号交联可增强由宿主MHC?的 APEs递呈肿瘤抗原问接活化的CD4T细胞功能, 从而促进宿主的抗肿瘤免疫H.GS1.-sOX40L融合 4MclntoshKR,KlyushnenkovaE,ShustovaVel.Suppressionofallo- reactiveTcellresponsesbyhumanMesenchymalsterncellsinvolves CD8cells【J].Blood,1999;94:133a. 5BlancKL,TammikL,SundbergBel.Mesonchymalstemcellsinhibit andstimulatemixedlymphocyteculturesandmitogenicresp0nsesindepen? dentlyofthemajorhistocompatibilitycomplex[J].ScandJImmunol, 2003;57:11. 6BarryFP,BoyntonRE,HaynesworthSel.Themonoclonalantibody SH一2,raisedagajnsthumanmesenchymalsterncells,recognizesanepitope OBend0glin(CD105)[J].BiochemBiophysResCommun,1999;265: 134. 7呼莹,马丽,马冠杰el.成人和胎儿骨髓间充质干细胞的 比较研究[J].中华血液学杂志,2002;12(8):645. 8KobieJJ,WuRS,KurtRAel.Transformingfactorbetainhib— itstheantigen—presentingfunctionsandanfitumoractivityofdendriticcell vaccines【JJ.Can~l-Res,2003;63:1860. 9BommireddyR,OrmsbyI,YinMela1.TGF-beta1inhibitsCa2'-calci— neurin-mediatedactivationinthymocytes[J].JImnmnol,2003;170: 3645. 10BommireddyR,SaxenaV.OnmcbyIel.TGF-beta1regulateslympho— cytehomeostasisbypreventingactivationandsubsequentapoptosisofpe— ripbemllymr,bocytes[J].JImmunol,2003;170:4612. [收稿2003—12-29修回2004-04-13] (编辑许四平) 蛋白为体外获得功能性T细胞提供了又一途径,并 为研究OX40/OX40L信号提供研究手段. 4参考文献 1孙建军,施勤.OX40/OX40L的生物学特征及功能[J].上海免疫 学杂志,2003;23(2):136-138. 2GramagliaI.WeinbergAD.LemonMel.Ox-40ligand:apotentCOS— timulatorymoleculeforsustainingprimaryCD4Tcell[J].JIm— munol,1998;161(2):6510-6517. 3WeatherillAR,MaxwellJR.TakahashiCel.OX40ligationenhances cellcycleturnoverofAg-activatedCIMTcellsinvivo[J].Celllmmu— nol,2001;209(1):63.75. 4WeinbergAD.OX40:targetedimnmr~therapy-implicationsfortempering autoinmaunityandenhancingvaccines[J].TrendsImmunol,2002;23 (2):102.109. [收稿2003—09.10修回2003—11-24] (编辑徐杰)