酶工程原理与技术 郭勇 笔记 重点 精要

绪论 酶的生产与应用的技术过程称为酶工程 第一节酶的基本概念 同时酶的催化作用具有:专一性、高效性,作用条件温和等特点 第二节酶的分类与命名 按其化学组成不同,酶可以分为主要由蛋白质组成蛋白类酶(P酶)和主要由核糖核酸组成的核酸类酶(R酶)两大类别。蛋白类酶和核酸类酶的分类命名的总原则是相同的(根据酶的作用底物和催化反应的类型),同时又有所区别 一、蛋白类酶的分类与命名 推荐名:在惯用名称的基础上,加以选择和修改而成。 酶的推荐名一般由两部分组成:第一部分为底物名称,第二部分为催化反应的类型。后面加一个“酶”字( -ase)。不管酶催化的反应是正反应还是逆反应,都用同一个名称。 系统名称( Systematic name):包括了酶的作用底物,酶作用的基团及催化反应的类型。 (一)蛋白类酶(P酶)的分类原则 按照酶催化作用的类型,将蛋白类酶分为 6 大类。 第 1 大类,氧化还原酶第 2大类,转移酶第 3 大类,水解酶第 4 大类,裂合酶第 5 大类,异构酶第 6 大类,合成酶(或称连接酶) 每个大类中,按照酶作用的底物、化学键或基团的不同,分为若干亚类。 每一亚类中再分为若干小类。 每一小类中包含若干个具体的酶 六大类蛋白类酶简介 1、氧化还原酶( Oxidoreductases) 催化氧化还原反应,其催化反应通式为:AH2 + B = A +BH2 2、转移酶(Transferases)反应通式为:AB + C = A + BC 3、水解酶 (Hydrolases) 催化各种化合物进行水解反应的酶称为水解酶。 其反应通式为: AB + H2O = AOH + BH (4)裂合酶 (Lyases) 催化一个化合物裂解成为两个较小的化合物及其逆反应的酶成为裂合酶。 其反应通式为:AB =A + B 乙酰乳酸合酶( 2-乙酰乳酸+ CO2 = 2-丙酮酸) 5、异构酶 (Isomerases) 催化分子内部基团位置或构象的转换的酶称为异构酶 其反应通式为: A=B。 异构酶按照异构化的类型不同,分为 6 个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶(isomerase)、消旋酶(racemase)、变位酶(mutase)、表异构酶(epimerase)、顺反异构酶(cis-trans-isomerase)等。 6、连接酶(Ligases) 或合成酶(Synthetases) 连接酶是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解,催化两个分子进行连接反应的酶。 其反应通式为: A + B + ATP = AB + ADP + Pi 或 AB +AMP +PPi R酶采用的分类原则: ①根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其它分子,将核酸类酶分为分子内催化(in cis)R酶和分子间催化(in trans) R酶两大类。 ②在每个大类中,根据酶的催化类型不同,将R酶分为若干亚类。如剪切酶,剪接酶,多功能酶等 可将分子内催化的R酶分为自我剪切酶(Self-cleavage)自我剪接酶(Self-splicing)等亚类 分子间催化的R酶可以分为RNA剪切酶,DNA剪切酶,多肽剪切酶,多糖剪接酶等亚类。 ③在每个亚类中,根据酶的结构特点和催化特性的不同,分为若干小类。 第三节酶活力的测定 酶活力(enzyme activity)的大小可以用一定条件下酶所催化的反应初速度表示。在外界条件相同的情况下,反应初速度越大,酶的活力越高。 一、酶活力测定方法 酶活力测定的方法:化学测定法、光学测定法、气体测定法等。 酶活力测定的要求:快速、简便、准确。 酶活力测定的步骤: (1)根据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配制成一定浓度的底物溶液。 (2)根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 (3)在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间。 (4) 反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。 注意:若不能即时测出结果的,则要及时终止反应,然后再测定。 终止酶反应的方法: (1)加热使酶失活(2)加入适宜的酶变性剂(如三氯醋酸);(3)调节pH值;(4)低温终止反应。 二、酶活力单位 在特定条件下,每1 min 催化1 μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位(IU)国际上另一个常用的酶活力单位是卡特(Kat)。在特定条件下,每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特(Kat) 1Kat = 6×10 7 IU 酶的比活力是酶纯度的一个指标,是指在特定条件下,单位重量(mg)蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。 酶比活力=酶活力(单位)/ mg (蛋白或RNA) 三、酶的转换数与催化周期 酶的转换数(Kp),又称为摩尔催化活性(molar catalytic activity ),是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。 Kp是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为 min-1 转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒(msec)或微秒(μsec)。 四、固定化酶的活力测定 (4) 固定化酶的比活力测定:在固定化酶中,一般采用每克(g)干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。 即:比活力= 酶活力单位/ cm2 (5)酶结合效率与酶活力回收率的测定 酶结合效率又称为酶的固定化率,是指酶与载体结合的百分率。 酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。 (6)相对酶活力的测定 具有相同酶蛋白(或酶RNA)量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。 酶在应用过程中也表现出一些不尽人意之处: 活力不高 稳定性差 分离纯化困难 第一篇酶的生产 1、提取分离法 2、生物合成法 3、化学合成法 第一节细胞的选择 酶生产的细胞必须具备的条件: 1、酶的产量高 2、容易培养和管理 3、产酶稳定性好 4、利于酶的分离纯化 5、安全无毒 一、微生物 基本要求: 1不是致病菌 2发酵周期短,产酶量高 3不易变异退化 4最好是产生胞外酶的菌种,利于分离 5对医药和食品用酶,还应考虑安全性: 6由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。7非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。 第二节培养基的配制 一、培养基的基本成分 1、碳源 大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物,如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。 植物细胞以蔗糖为碳源;动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源 2、氮源:有机氮源和无机氮源两大类。 不同的细胞对氮源有不同的要求: 动物细胞要求有机氮源;植物细胞主要使用无机氮源;微生物细胞中,异养型细胞要求有机氮源自养型细胞采用无机氮源 在使用无机氮源时要注意铵盐和硝酸盐的比例 碳和氮两者的比例,即碳氮比(C/N),对酶的产量有显著影响。所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素(C)的总量与氮元素(N)总量之比。 培养基的设计原则 1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较 三、植物细胞培养基 1、植物细胞培养基的特点 (1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐 (2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素,如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。 (3)植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 (4)植物细胞一般以蔗糖为碳源 2、常用的植物细胞培养基 MS培养基:硝酸盐浓度高,广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养 B5培养基:铵盐浓度低,适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养 White培养基:无机盐浓度低,适合生根培养 KM-8P培养基:有机成分种类全面,广泛应用与原生质体的培养 (一)动物细胞培养基的组分 1氨基酸:必需氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸 2维生素:无血清需补充VB、VC 3无机盐:调节渗透压 4葡萄糖: 5激素:胰岛素、生长激素、氢化可的松 6生长因子:无血清需添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子 (二)动物细胞培养基的配制 第三节产酶工艺条件及其调节P45 培养基中溶解氧的量决定于一定条件下氧气的溶解速度 氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数,以Kd表示。溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。其单位通常以[ mmol氧/h·L]表示。 溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。 耗氧速率、细胞浓度的概念P48 第四节微生物发酵产酶 一、微生物发酵产酶的方式及其特点 固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵 二、提高酶产量的措施 1、添加诱导物(诱导物的分类:酶作用底物型诱导物酶的反应产物酶作用底物类似物作诱导物) 酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物,也不是酶的反应产物,而是可以与酶结合又不能被酶催化的底物类似物。 2、控制阻遏物浓度 3、添加表面活性剂表面活性剂分为离子型和非离子型两大类 适量的非离子型表面活性剂,如吐温(Tween)、特里顿(Triton)等可以加速胞外酶的分泌,而使酶的产量增加。离子型表面活性剂对细胞有毒害作用 4、添加产酶促进剂 三、酶发酵动力学 (一)酶生物合成的模式;同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型 中期合成型酶的共同特点是:酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用,而且酶所对应的mRNA稳定性差 滞后合成型的酶,之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成,主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长,阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后,酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物,该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好,可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内,继续进行酶的生物合成。 在酶的发酵生产中,为了提高产酶率和缩短发酵周期,最理想的合成模式应是延续合成型。 对于滞后合成型的酶,要设法降低培养基中阻遏物的浓度,尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用,使酶的生物合成提早开始; 对于中期合成型的酶,则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫,使其生物合成的开始时间提前,并尽量延迟其生物合成停止的时间。 (二)细胞生长动力学 1950年,法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程? 莫诺德方程中的μm 和KS可以通过双倒数作图法求出? 宏观产酶动力学的研究表明:产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。产酶动力学模型或称为产酶动力学方程可以表达为? (一)固定化细胞发酵产酶的特点 (1)提高产酶率(2)可以反复使用或连续使用较长时间(3)发酵稳定性好,对温度、pH的适应范围扩大,基因工程菌的质粒稳定,不易丢失:(4)缩短发酵周期,提高设备利用率(5)产品易于分离纯化(6)只适用于胞外酶等胞外产物的生产 固定化原生质体的特点 (1)变胞内产物为胞外产物:(2)提高酶产率:(3)稳定性较好:(4)易于分离纯化 固定化原生质体发酵产酶在工艺条件控制方面需要注意下列问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 : (1)渗透压的控制:(2)防止细胞壁再生:(3)保证原生质体的浓度 第五节植物细胞培养产酶 一、植物细胞的特性 与微生物相比:细胞大;生长速率、代谢速率低,倍增时间、生产周期长;营养要求简单;大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间;对剪切力敏感;主要目的产物为色素、药物、香精和酶 第六节动物细胞培养产酶 动物细胞主要用于生产疫苗、激素、多肽生长因子、酶:胶原酶、尿激酶等单克隆抗体、 非抗体免疫调节剂 一、动物细胞的特性 没有细胞壁;适应环境的能力差,脆弱细胞大;以集群形式存在,细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性、功能全能性;营养要求复杂 第四章酶的分离纯化:1、机械破碎法2、物理破碎法 (1、温度差破碎法:热胀冷缩2、压力差破碎法:高压冲击法突然降压法渗透压变化法 超声波破碎法)3、化学破碎法(有机溶剂表面活性剂)4、酶促破碎法自溶法 溶菌酶、β-葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等 酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。 二、影响酶提取的主要因素 主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外,还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响 第三节沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,而从溶液中沉淀析出,与其它溶质分离的技术过程沉淀分离的方法主要有:盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等 一、盐析沉淀法 盐析沉淀法简称盐析法,是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从而使酶与杂质分离的过程 一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶。 而在盐浓度升高到一定浓度后,蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出,这种现象称为盐析盐之所以会改变蛋白质的溶解度,是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用,使蛋白质分子表面的电荷改变,同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度,使分子表面的水化膜改变 饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值 饱和硫酸铵的配制方法: 过量硫酸铵——50~60℃保温——趁热过滤——0或25 ℃平衡1~2天——有固体析出即为饱和硫酸铵溶液 二、离心方法的选择 对于超速离心,可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。 1、差速离心:差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 2、密度梯度离心 样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。 3、等密梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时,在离心力的作用下,不同浮力密度的颗粒或向下沉降,或向上飘浮,只要时间足够长,就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置(等密度点),形成区带。这种方法称为等密梯度离心,或称为平衡等密度离心。等密梯度离心常用的离心介质是铯盐, 离心条件:离心机、离心方法、离心介质、密度梯度、离心力(或离心速度)和离心时间 第五节过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4 大类 第六节层析分离 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同,使各组分以不同比例分布在两相(固定相、流动相)中。 当流动相流经固定相时,各组分以不同的速度移动,从而使不同的组分分离纯化。 分离纯化酶常采用:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等 一、吸附层析 1、吸附层析原理: 任何两个相之间都可以形成一个界面,其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。 凡是能够将其它物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。吸附剂一般是固体或者液体,在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的。 吸附层析通常采用柱型装置,先装柱、加液,而后洗脱 在洗脱时,层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 适当时间后,不同物质在吸附柱内形成各自的区带 2、洗脱方法 三种方法:溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法 3、吸附剂与洗脱剂的选择 ①吸附剂的选择:吸附层析的关键因素 极性物质容易被极性表面吸附;非极性物质容易被非极性表面吸附;溶解度越大的物质越难被吸附。吸附剂可分为无机吸附剂和有机吸附剂。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成,比表面积很大 ②洗脱剂的选择:要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。 对于极性组分,用极性大的溶剂洗脱效果较好。而对于非极性组分,则用非极性溶剂洗脱较佳。 洗脱剂的种类有:饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。 洗脱剂的选择要注意下列各点: 洗脱剂不会与吸附剂起化学反应,也不会使吸附剂溶解。 洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大,粘度小,流动性好,容易与被洗脱的组分分离。 洗脱剂要求一定的纯度,以免杂质对分离带来不利影响 二、分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同,而使各组分分离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时,该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后,分配系数是一常数,以K表示。 三、离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 按活性基团的性质不同,离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂 由于酶分子具有两性性质,所以可用阳离子交换剂,也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 在溶液的pH值大于酶的等电点时,酶分子带负电荷,可用阴离子交换剂(引入碱性基团)进行层析分离; 四、凝胶层析 又称为凝胶过滤,分子排阻层析,分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 1 、凝胶层析的基本原理 凝胶层析柱中装有多孔凝胶,当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时,大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢,从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱,而达到分离的目的 凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程 五、亲和层析原理 六、层析聚焦原理 (1)电场强度是指每厘米距离的电压降。 (2)溶液的pH值:(3)溶液的离子强度: (4)电渗: 8.1有机溶剂萃取 用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如,用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶;用苯酚萃取RNA等。由于有机溶剂容易引起酶蛋白和酶RNA的变性失活,所以在酶的萃取过程中,应在0~10℃的低温条件下进行,并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。 8.2双水相萃取 双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。 双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。 在双水相系统中,蛋白质、RNA等在两相中的溶解度不一样,分配系数不同,从而达到分离 8.3超临界萃取 超临界萃取又称为超临界流体萃取,是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术物质在不同的温度和压力条件下,可以以不同的形态存在,如固体(S)、液体(L)、气体(G)、超临界流体(SCF)等。 目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO2。 8.4反胶束萃取: 反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 反胶束,又称为反胶团,是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统 胶束与反胶束的形成:将表面活性剂溶于水中,并使其浓度超过临界胶束浓度,表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体。通常将在水溶液中形成的聚集体胶束,称为正胶束 如果将表面活性剂溶于非极性溶剂中,并使其浓度超过临界胶束浓度,便会在有机溶剂内形成聚集体,这种聚集体称为反胶束 反胶束系统萃取方法的基本过程是:首先在酶蛋白相转移最佳的条件下,将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步,在最佳条件下,将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相的,即将酶从有机相中提取出来。 最常用的是阴离子表面活性剂。 第九节结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。通常酶的纯度应当在50%以上,方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高,越容易进行结晶 盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电点结晶 第十节酶的浓缩、干燥 浓缩:从低浓度溶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。 干燥方法:真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥 使酶催化特性得以改进的技术有很多,主要有:酶分子修饰(enzyme molecule modification)技术、酶固定化(enzyme immobilization)技术、酶的非水相催化(enzyme catalysis in non-aqueous phase)技术、酶的定向进化(enzyme directed evolution)技术等 第六章酶分子修饰 酶分子修饰的方法 第一节酶分子的主链修饰 利用酶分子主链的切断和连接,使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变,从而改变酶的特性和功能的方法,称为酶分子主链修饰 一、主链的切断修饰 主链切断后可能出现三种情况 (1)酶中心被破坏,催化功能丧失(2)催化功能保持不变或损失不多,抗原性降低 (3)有利于酶活性中心的形成,催化功能提高 多酶融合体:具有两种或多种催化活性的酶 双头酶:一条主链具有两种酶活性的酶 第二节酶分子的侧链基团修饰 采用一定的方法(一般为化学法)使酶蛋白的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。 侧链修饰的意义: 可研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。可测定某一基团在酶分子中的数量;可提高酶活力、增加稳定性、降低抗原性、提高酶的使用价值;可能获得新酶种 蛋白类酶和核酸类酶的侧链基团不同,修饰方法也有所区别。(1)酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变,从而改变酶的特性和功能。(2)核酸类酶主要由核糖核酸(RNA)组成,酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基,核糖上的羟基,嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基(酮基)等。 酶的侧链基团修饰方法主要有:氨基修饰,羧基修饰,巯基修饰,胍基修饰,酚基修饰,咪唑基修饰,吲哚基修饰,分子内交联修饰等。 大分子结合修饰的作用: (1)通过修饰提高酶活力::(2)通过修饰可以增强酶的稳定性: (3)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性 第三节酶的组成单位置换修饰 一、酶分子组成单位修饰的作用 1、通过修饰可以提高酶活力 2、通过修饰可以增强酶的稳定性 3、通过修饰可以使酶的专一性发生改变 4、通过核苷酸置换修饰可以获得各种人造核酸类酶氨基酸或核苷酸的置换修饰现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。 定点突变是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。点突变技术用于酶分子修饰的主要过程:1、新的酶分子结构的设计(基因序列分析、蛋白质结构分析、酶活性中心分析)2、突变基因碱基序列的确定3、突变基因的获得(引物设计进行基因定点突变——PCR 技术)4、新酶的获得(酶基因克隆表达、变异特性分析) 第四节酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 酶分子中所含金属离子往往是酶活性中心的组成部分。若从酶分子中除去其所含的金属离子,酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子,酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换,则可使酶呈现出不同的特性。 第五节酶分子的物理修饰 酶修饰后的性质变化 1、热稳定性 2、抗原性 3各类失活因子的抵抗力 4、半衰期 5最适pH 6、Km的变化 第七章酶固定化 酶在生产实践中的一些不足之处: (1)酶的稳定性较差(2)酶的一次性使用(3)产物的分离纯化较困难 固定化酶的优缺点 优点: (1)极易将固定化酶与底物、产物分开;产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺. (2)可以长时间、反复使用,有利于工艺的连续化、管道化 (3)酶反应过程可严格控制,有利于工艺自动化和微电脑化。 (4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 (5)较能适应于多酶反应。 (6)酶的使用效率、产物得率提高,质量有保障,成本低。 缺点: (1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本,使工厂开始投资大。 (2)比较适于水溶性底物和小分子底物。 (3)与完整细胞比较,不适于多酶反应,特别是需要辅因子的反应。 (4)对胞内酶需经分离后才能固定化。 第一节固定化方法 (一)五大类方法: 吸附法结合法交联法包埋法热处理法 (二)选择方法依据: 1、酶的性质 2 、载体的性质 3 、制备方法对酶的影响 (三)固定化后酶的考察项目: 1 、测定固定化酶的固定化率以及酶活力回收率。 2 、考察固定化酶稳定性 3 、考察固定化酶最适反应条件 二、酶的固定化方法 (一)吸附法 利用各种固体吸附剂作为载体将酶或含酶菌体吸附在其表面上,而使酶固定化的方法称为物理吸附,又简称吸附法。 选择载体的原则: (1)要有巨大的比表面积(2)要有活泼的表面(3)便于装柱进行连续反应。 物理吸附法常用的固体吸附剂有: 活性炭氧化铝硅藻土多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、硅胶羟基磷灰石、金属丝网等 影响吸附的因素主要有:酶分子表面的电荷介质中离子强度 pH 温度 蛋白质浓度及酶和载体的特性 酶分子表面的电荷 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷,能有效的克服固定化酶的解吸作用。 吸附法的优点:操作简单、条件温和。可选择的载体种类多。吸附过程可以同时纯化酶。固定化酶在使用过程失活后可重新活化。载体可以回收再利用。 吸附法的缺点:某些吸附过程的机理还不是十分明了,在给酶量、吸附程度以及固定化酶活力回收等方面的不可预见性大。易脱落,影响产物纯度和酶的操作稳定性。 (二)包埋法 1、凝胶包埋法 载体:琼脂凝胶海藻酸钙凝胶角叉菜胶明胶聚丙烯酰胺凝胶 2、半透膜包埋法 常用半透膜:聚酰胺膜火棉胶膜 包埋法的特点 优点:包埋法操作简单,由于酶分子只被包埋,未受到化学反应,可以制得较高活力的固定化酶.对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。 不足:只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络,而对大分子底物不适宜;同时,凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。 (三)结合法 选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 1、离子键结合法: 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法 所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 2、共价键结合法: 所用载体主要有:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。 ①重氮法②叠氮反应 3溴化氰法烷基化法 (四)交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 (五)热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体内,而制备得到固定化菌体。 热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化,在加热处理时,要严格控制好加热温度和时间,以免引起酶的变性失活 第二节固定化酶的特性 一、稳定性二、最适温度三、最适pH值四、底物特异性 第八章酶的非水相催化 非水介质:有机溶剂介质,超临界流体介质,气相介质,离子液介质等 一、有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象,所以能够发挥其催化功能。 二、气相介质中的酶催化 气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低,扩散容易,所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点 三、超临界流体介质中的酶催化 超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。 用于酶催化反应的超临界流体应具有的特点 对酶的结构没有破坏作用,对催化作用没有明显的不良影响; 具有良好的化学稳定性,对设备没有腐蚀性; 超临界温度不能太高或太低,最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近; 超临界压力不能太高,可节约压缩动力费用; 超临界流体要容易获得,价格要便宜等 四、离子液介质中的酶催化 离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。 离子液(ionic liquids)是由有机阳离子与有机(无机)阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类,挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点 非水相介质中酶催化的特点 1、可以将加水分解反应转为其逆反应 2、酶的热稳定性高 3、容易回收和反复利用 4、改变酶对底物的专一性 5、提高有机化合物(尤其是非极性底物)的溶解度 6、低沸点溶剂中可容易分离纯化产物 7、能抑制依赖于水的某些不利反应 8、没有微生物的污染 9、非水系统中酶不易脱离吸附表面,易于酶的固定化 胶束又称为正胶束或正胶团,是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂,加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂包在液滴内部。反应时,酶在胶束外面的水溶液中,疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。 反胶束又称为反胶团,是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中,含有少量的水溶液,加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内,非极性端朝外,水溶液包在胶束内部。反应时,酶分子在反胶束内部的水溶液中,疏水性底物或产物在反胶束外部,催化反应在两相的界面中进行 第二节水对非水相介质中酶催化的影响 酶在完全非水环境中没有催化活性 酶在有机介质中进行催化反应时,水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系,水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关 在维持酶活力中起决定作用的是酶的结合水,并不是体系的总含水量。有机溶剂种类也影响酶的需水量 一、水与酶的柔性 酶分子有相对刚性和柔性两个部分 根据酶与底物的诱导契合原理,酶活性部分保持一定的柔性是酶表现其催化活性所必需 二、结合水 在有机介质体系中,酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。 在一般情况下,最适水含量随着溶剂极性的增加而增加 三、水活度(Aw) 是指在一定温度和压力下,反应体系中水的摩尔分数χw与水活度系数γw的乘积 Aw= χw ×γw 在低压条件下,水活度Aw是气相中水的分压与同温度下纯水的蒸气压的比值 Aw=(Yw × P) / P0 = Pw / P0 最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。在给定的有机溶剂中,水活度随水含量的增加而增大; 对于给定的Aw,疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂要少 四、水对酶活力选择性的调节 研究表明:有机相酶促反应中每个酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下,与溶剂的极性没有关系;但是水活度对酶活力的影响程度随着溶剂的不同而不同(P180图8-3) 水对酶的立体选择性也有一定的调节作用 第三节有机溶剂对有机介质中酶催化的影响 (1)有机溶剂对酶结构与功能的影响: 有些酶在有机溶剂的作用下,其空间结构会受到某些破坏,从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。 A 有机溶剂对酶分子表面结构的影响:酶在有机介质中与有机溶剂接触,酶分子的表面结构将有所变化 B 有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响: 当酶悬浮于有机溶剂中,有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心,与底物竞争活性中心的结合位点,降低底物结合能力,从而影响酶的催化活性。 有机溶剂分子进入酶的活性中心,会降低活性中心的极性,可能降低酶与底物的结合能力。 (2)有机溶剂对酶活性的影响: 有些有机溶剂,特别是极性较强的有机溶剂,如甲醇,乙醇等,会夺取酶分子的结合水,影响酶分子微环境的水化层,从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。 有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大,表明其极性越小;反之极性系数越小,则极性越强。 研究表明,有机溶剂的极性越强,越容易夺取酶分子结合水,对酶活力的影响就越大。极性系数lg P< 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。 (3)有机溶剂对底物和产物分配的影响: 第四节非水相中酶催化的特性 一、热力学稳定性 二、酶的特异性 1、底物选择性: 在有机介质中,由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化,致使酶的底物特异性会发生改变。不同的有机溶剂具有不同的极性,所以在不同的有机介质中,酶的底物专一性也不一样。 在极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物容易反应;而在极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物容易反应 2、立体选择性 又称为对映体选择性,是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。 3、位置选择性和化学选择性 4、其他特性 分子记忆:根据分子识别理论,酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象,从而获得与配体类似物结合的能力,这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆 pH记忆:在有机介质反应中,酶所处的pH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液 pH 值相同。这种现象称之为pH记忆 第五节非水相中酶催化反应的条件及其控制 酶在有机介质中可以催化多种反应,主要包括:合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。 酶在有机介质中的各种催化反应受到各种因素的影响:酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类,水含量、温度、pH和离子强度等 1、酶的选择(在酶催化反应时,通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度,所以酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高,两者成正比) 2、底物的选择和浓度控制 3、有机溶剂的选择 4、水含量的控制 5、温度控制 6、 pH值的控制: 第十章酶反应器 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :反应器生产能力的大小和产品质量的高低 第一节常见的酶反应器类型 按结构区分 搅拌罐式反应器鼓泡式反应器填充床式反应器流化床式反应器膜反应器喷射式反应器 按操作方式区分 分批式反应连续式反应流加分批式反应 混合形式 连续搅拌罐反应器分批搅拌罐反应器 一、搅拌罐式酶反应器 1、分批搅拌罐式反应器。其特点是:底物与酶一次性投入反应器内,产物一次性取出;反应完成之后,固定化酶(细胞)用过滤法或超滤法回收,再转入下一批反应。 2、连续搅拌罐式反应器 向反应器投入固定化酶和底物溶液,不断搅拌,反应达到平衡之后,再以恒定的流速连续流入底物溶液,同时,以相同流速输出反应液(含产物)。 二、填充床式反应器 优点:高效率、易操作、结构简单等,因而,PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液,以及有产物抑制的转化反应。 缺点:传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时,不宜采用PBR。 三、流化床反应器 四、鼓泡式反应器 鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR)是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡,在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。 鼓泡式反应器可以用于游离酶和固定化酶的催化反应。鼓泡式反应器的结构简单,操作容易, 剪切力小,物质与热量的传递效率高,是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。 五、膜反应器 将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应,也可以用于固定化酶的催化 反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中,而制成的一种生物反应器。 六、喷射式反应器 喷射式反应器是利用高压蒸汽的喷射作用,实现酶与底物的混合,进行高温短时催化反应的一种反应器 各种酶反应器的特点 第二节酶反应器的选择和使用 影响酶反应器选择的因素很多,但一般可以从以下几个方面考虑: 酶的形式(游离/固定化..) 固定化酶的形状底物的物理性质酶反应动力学性质酶的稳定性操作要求反应器制造、控制成本 1、根据酶的应用形式选择反应器: 在体外进行酶催化反应时,酶的应用形式主要有游离酶和固定化酶。 (1)游离酶反应器的选择: 可以选用:搅拌罐式反应器膜反应器鼓泡式反应器喷射式反应器等。 ①游离酶催化反应最常用的反应器是拌罐式反应器。 ②对于有气体参与的酶催化反应,通常采用鼓泡式反应器。 ③对于某些价格较高的酶,由于游离酶与反应产物混在一起,为了使酶能够回收,可以采用游离酶膜反应器。 ④对于某些耐高温的酶,如高温淀粉酶等,可以采用喷射式反应器,进行连续式的高温短时反应。 (2)固定化酶反应器的选择: 应用固定化酶进行催化反应,可以选择搅拌罐式反应器、填充床式反应器、鼓泡式反应器、流化床式反应器、膜反应器等。 颗粒状的固定化酶可以采用搅拌罐式反应器、填充床式反应器、流化床式反应器、鼓泡式反应器等进行催化反应。 2、根据酶反应动力学性质选择反应器: (1)必须保证酶分子与底物分子能够有效碰撞,为此,必须使酶与底物在反应系统中混合均匀。 搅拌罐式反应器、流化床式反应器均具有较好的混合效果。填充床式反应器的混合效果较差。在使用膜反应器时,也可以采用辅助搅拌或者其他方法,以提高混合效果,防止浓差极化。 (2)底物浓度的高低对酶反应速度有显著影响。 具有高浓度底物抑制作用的酶,如果采用分批搅拌罐式反应器,可以采取流加分批反应的方式进行反应。 对于具有高浓度底物抑制作用的游离酶,可以采用游离酶膜反应器进行催化反应; 对于具有高浓度底物抑制作用的固定化酶,可以采用连续搅拌罐式反应器、填充床式反应器、流化床式反应器、膜反应器等进行连续催化反应 (3)有些酶催化反应,其反应产物对酶有反馈抑制作用。对于具有产物反馈抑制作用的固定化酶,也可以采用填充床式反应器。 (4)某些酶可以耐受100℃以上的高温,最好选用喷射式反应器 3根据底物或产物的理化性质选择反应器: (1)反应底物或产物的分子质量较大时,由于底物或产物难于透过超滤膜的膜孔,所以一般不采用膜反应器。 (2)反应底物或者产物的溶解度较低、粘度较高时,应当选择搅拌罐式反应器或者流化床式反应器,而不采用填充床式反应器和膜反应器,以免造成阻塞现象。 (3)反应底物为气体时,通常选择鼓泡式反应器。 (4)有些需要小分子物质作为辅酶(辅酶可以看作是一种底物)的酶催化反应,通常不采用膜反应器,以免辅酶的流失而影响催化反应的进行 4、所选择的反应器应当能够适用于多种酶的催化反应,并能满足酶催化反应所需的各种条件,并可进行适当的调节控制。 5、所选择的反应器应当尽可能结构简单、操作简便、易于维护和清洗。 6、所选择的反应器应当具有较低的制造成本和运行成本 酶反应器使用中应注意的问题 酶的稳定性对酶反应器的功效是很重要的。在操作过程中,有时需要用酸或碱来调节反应液PH。如果局部的pH过高或过低,就会引起酶的失活,或者使底物和产物发生水解反应。这时,可用加快搅拌已促使混合均匀。如果底物和产物在反应器中不够稳定的话,可以采用高浓度的酶,以减少底物和产物在反应器中的停留时间,从而减少损失。 防止微生物污染 酶反应器操作中,生产能力逐渐降低,主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因: (1)酶本身的失活;(2)酶从载体上脱落;(3)载体的破碎或溶解 从生物中提取的具有生物催化能力的酶,辅以其他成分,用于加速加工过程和提高产品质量的制品,称为酶制剂。 第九章酶应用的基本理论 第一节酶的催化特性 一、酶催化作用的特点:专一性强效率高 二、影响酶催化活性的因素 温度、pH 、激活剂和抑制剂 第二节酶反应动力学 酶反应动力学是研究酶催化反应速度及其影响因素的学科,使美学研究的重要内容,也是酶应用的重要理论基础