大鼠三叉神经节垂体腺苷环化酶激活肽免疫反应神经元对松果体的神经支配_cropped

大鼠三叉神经节垂体腺苷环化酶激活肽免疫反应神经元对松果体的神经支配_cropped 〃论 著〃 大鼠三叉神经节垂体腺苷环化酶激活肽免疫反应 神经元对松果体的神经支配 333刘 伟 金芳华 何建波 彭华 ()中山大学附属第二医院耳鼻喉科 ,广州 510120 ( ) 【摘要】 目的 证实大鼠松果体的垂体腺苷环化酶激活肽 PACAP免疫反应神经纤维来源于三叉神经节神经元 。方法 采用颞下窝入路切断大鼠眼2上颌神经 ,存活 3 d,1 周后 ,观察松果体的 PACAP 免疫反应神经纤维并计数 ,与未经手术的对 照组动物比较 。结果 在切断了眼2上颌神经的大鼠 ,其松果体的 PACAP 免疫反应神经纤维明显减少 。结论 大鼠三叉神经 节是松果体 PACAP 能神经纤维的主要来源 ,该类神经纤维可能参与调节松果体腺细胞分泌褪黑素 。 【关键词】 三叉神经节 ; 眼2上颌神经 ;垂体腺苷环化酶激活肽 ; 松果体 Innervation of the rat pineal gland by pituitary a denylate cyclase activating polypeptide ( PACAP)2immunoreactive nerve f ibres originating in the trigeminal ganglion Wei Liu , Jin Fanghuan , Peng Hua , He Jianbo. Department of Ear Nose and Throat , The Second Aff iliated Hospital , S un Yat2Sen University . Guangzhou 510282 China 【Abstract】 Objective To prove that the pineal gland was innervated by the PACAP2immunoreactive nerve fibres originating in the trigeminal ganglion. Method Ophthalmic and maxillary nerves were transected by using a subtemporal fossa approach. Over three days after , the number of PACAP2immunoreactive nerve fibres in the pineal gland of the rats with a total transection of the nerve was compared with that of the rats without surgery. Result In the operated rat , PACAP2immunoreactive nerve fibres in their superficial pineal decreased remarkably. Conclusion The trigeminal ganglion is the origin of pineal PACAP2immunoreactive nerve fibres. These nerves may regulate the synthesis and/ or secretion of melatonin in the pineal gland. 【 Key words】 Trigeminal ganglion ; Ophthalmic2maxillary nerve ; Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide ; Pineal gland 1 ,2 ( ) 松果体腺细胞分泌褪黑素, 与腺垂体结节 SP2IR和 降 钙 素 基 因 相 关 肽 免 疫 反 应 免疫 反 应 12 部和下丘脑视交叉上核神经元的 G2蛋白偶联膜结 () CGRP2IR共存。在沙鼠 , 应用逆行追踪和免疫 3 合受体结合。在光周期动物 ,褪黑素与其受体结 组化结合的方法发 现 松 果 体 CGRP2IR 神 经 纤 维 起 14 12 ( )合调节其生殖功能 ,并使视交叉上核 脑内生物钟 源于三叉神经节。进而 ,切除颈上神经节、蝶 腭神经节和耳神经节 ,对松果体 CGRP2IR 神经纤维 与光亮2黑暗周期同步 。松果体腺细胞分泌褪黑素 4 数量无 影 响 。另 外 , 三 叉 神 经 节 含 有 PACAP2IR 神 受多个神经通路调节,其中颈上交感神经节占重 15 5 经元 胞 体。因 此 , 本 文 试 图 探 讨 大 鼠 松 果 体 要位置。但是 ,哺乳动物松果体具有多种肽类神 CGRP2IR 神经纤维来源于三叉神经节的可能性 。 经纤维 。在上述交感神经纤维 ,神经肽 Y 与肾上腺 6 素共存。另外 ,松果体内有含 VIP 和 PHI 的非交 7 ,8 1 材料和方法 感神 经 纤 维。近 年 来 , 用 受 体 放 射 自 显 影 技 9( 1 . 1 动物与手术 在鼠松果体发现了 PACAP 垂体腺苷环化酶激 术 ) 活肽结合部位 。PACAP 可以刺激大鼠松果体细胞 成年 雄 性 Wistar 大 鼠 , 体 重 约 250 , 300 g , 在10 合成褪黑素,而且这种刺激作用主要是通过激活 ( ) 12/ 12 h 光亮/ 黑暗 早晨 6 时起给光条件下饲养 ,11 松果体的 VIP1/ PACAP 受体亚型实现的。PACAP 食水自取 。手术组动物共 20 只 ,对照组动物 6 只 。 1 ,2( ) 免疫反应 PACAP2IR神经纤维已在大鼠松果体 为行双侧眼2上颌神经切断术 ,动物用三溴乙醇 13 和羊松果体内被显示 。 在大鼠松果体的神经纤() 经腹膜腔注射 250 mg/ kg麻醉后 ,仰卧位置于手术 维 , PACAP2IR 与 P 物质 台上 ,固定四肢 。先在颈下部行气管切开术 ,用电凝 12 ( ) 颞下窝的手术中用于牵开颞下窝的牵开器压迫气管biotinylated tyramide amplification procedure: 切片 ,均采用颈前两 造成窒息 。对于眼2上颌神经的显露 在 4 ?下 经 抗 PACAP 抗 体 孵 育 12 , 18 h 后 , 用 ( ) ( 侧垂直切口 。切开皮肤和皮下组织后 ,钝性分离出 0125 %牛 血 清 白 蛋 白 含 011 % Triton X2100PBS2 () ) BT洗切片 10 min 〓3 次。在室温下用生物素化兔甲状舌骨肌和下颌骨 ,在两者之间用蚊氏钳向背侧 ( 分离直到显露出翼内肌及其在翼状窝的附着处 。用 E464 ,Dako , Glostrup ,Denmark ; 稀 释 1 ? 抗鼠 抗 血 清 ) 1 600曲别针作成的拉钩保持该显露状态 。 孵育切片 60min 。用 PBS2BT 洗切片 5 min 〓3 ( 次后 , 室 温 下 在 ABC2过 氧 化 物 酶 复 合 体 Vector , 为了显露眼2上颌神经 ,将翼内肌附着处的吻侧 ) Burlingame ,USA ;稀释 1?150中孵育 30 min 。用 PBS2 部分从翼状窝骨面分离 。分离时注意勿损伤外侧的 BT 洗 5 min 〓3 次 后 , 切 片 在 生 物 素 化 酪 胺 盐 脑膜中动脉 ,因为该分离过程在脑膜中动脉与内侧 () DuPont NEN , Boston , MA ; 稀 释 1 ?100中 孵 育 。用 的翼内板和尾侧的岩鼓缝围成的近似三角区内进行 PBS2BT 洗 5 min 〓3 次后 ,用 ABC2过氧化物酶复合 () 图 1。将 该 区 域 内 的 颅 底 骨 质 用 电 钻 小 心 地 磨 ( ) 体孵育 稀 释 1 ?150。用 PBS2BT 洗 切 片 5 min 〓2除 ,当接近颅内颅底时 ,用细钩挑除该靠近眼2上颌 () 次后 ,再用 0105M TRIS p H 716洗 10 min 。切片在神经的薄层骨壁 。暴露出的眼2上颌神经为完整的 0105 % 3 ,3π2二氨基联苯胺/ HCl 和 01005 % HOin 22 一束 ,其直径约为 2,3mm 。所磨的骨也与之近似 , () TRIS/ HCL 缓冲液 p H 716中 孵 育 15 min 。用 蒸 馏 以充分暴露神经而又不损伤周围的结构 ,尤其是圆 R 水洗 切 片 终 止 反 应 。最 后 , 切 片 干 后 用 Depex封 孔 。我们用电凝和细钩完全离断神经后 ,去除拉钩 , 片 。在 Zaiss 显微镜下观察结果并照相 。 缝合切口 ,吸去大鼠咽腔和气管内的分泌物 ,关闭气 计数每只大鼠近松果体中线 8 张切片的 PACAP 管皮肤瘘 。将大鼠置于温暖环境中 ,直到苏醒 。 免疫反应神经纤维 ,算出手术和对照组每只动物的 神经纤维平均数 。两个实验组神经纤维平均数间的 比较用 Mann2Whitney 非配对 t 检验 。为检验 PACAP ( μ) 抗血清的特异性 , 采用经用抗原 20 g/ ml 预吸收 的抗体孵育切片 ,结果反应为阴性 。 2 结果 对照 组 松 果 体 的 PACAP2IR 神 经 纤 维 数 量 多 () 图 2A。这些神经纤维先进入松果体包膜 ,然后或( ) 图 1 去除部分翼状窝骨质 斜线部分以暴露神经 。主 沿血管走行或分布于松果体细胞之间的腺实质中 。 ( ) ( ) 要的临近结构包括岩骨缝 PTF、鼓泡 TB、内侧翼 这种 分 布 形 式 也 见 于 其 他 种 类 的 松 果 体 神 经 纤 () ( ) () 状板 MPP、颈外动脉孔 ECF、卵圆孔 OF、脑膜 17维 。 () 中动脉 MMA。 经手术的 20 只大鼠 ,6 只的眼2上颌神经被完全 1 . 2 灌注固定和冰冻切片 切断 ,其它则为部分切断 。该 5 只眼2上颌神经被完 () 手术后 2,7 d ,用三溴乙醇 250 mg/ kg重新麻 全切断的 大 鼠 之 松 果 体 的 PACAP2IR 神 经 纤 维 , 包 () 醉动物 。经心脏灌注肝素化的 15 000 IU/ L磷酸钠 括被膜 上 和 腺 实 质 中 的 神 经 纤 维 , 对 照 组 被 膜 为 (() 缓冲液 p H 714,继而灌注 Stephanini 固定液 2 %多 25183 〒5142 ;手术组被膜为 11167 〒3175 ; 对照组腺 聚甲醛 ,012 %苦味酸 ,用 011M 磷酸钠缓冲液稀释 , 实质为 14158 〒6167 ; 手术组腺实质为 0142 〒0104 ,) p H 712。灌注 10 min 后 ,取出松果体 、三叉神经节 均显著少于对照组大鼠 ; 腺实质中的神经纤维减少 和三叉 神 经 , 在 相 同 的 固 定 液 中 后 固 定 24 h 。入 更加显著 ,在一些切片几乎完全消失在眼2上颌神经 20 %蔗糖溶液过夜后 ,用冷冻切片机对松果体行矢 ( ) 被部分切断的大鼠 图 2B, PACAP2IR 神经 纤 维 的 μ状方面的切片 ,厚 25 m ,收集在明胶玻片上 。 减少不明显 ,说明切断神经以前的操作不影响松果 1 . 3 免疫组织化学反应体的 PACAP2IR 神经纤维数量 。 ( 用小 鼠 抗 PACAP 单 克 隆 抗 体 为 第 一 抗 code 3 讨论 no . Mab J HH1 , Bispebjerg Hospital , Denmark ; 稀 释 16 以上研 究 结 果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 , 大 鼠 松 果 体 的 PACAP2IR ) 1?5, 采 用 以 下 生 物 素 化 酪 胺 盐 放 大 步 骤 ( ) adenylate cyclase activating polypeptide PACAP: comparison 神经纤维起源于三叉神经节 。切除颈上神经节 、蝶 ( ) with vasoactive intestinal polypeptide VIP binding site 腭神经节和耳神经节对松果体 PACAP2IR 神经纤维 localization in rat brain sections. Brain Res , 1992 , 575 : 113, () 数量无影响 另文发表。因此 ,可以排除这些部位 123. 是大鼠松果体 PACAP2IR 神经纤维的主要来源 。10. Simonneaux V ,Ouichou A ,Pevet P. Pituitary adenylate cyclase2 三叉神经节中有支配脑血管的 CGRP2IR 和 SP2( ) activating polypeptide PACAPstimulates melatonin synthesis 18 ,19from rat pineal gland. Brain Res ,1993 ,603 :148,152. ,我们还知道刺激这些神经引起脑动IR 的胞体 19 11. Simonneaux V , Kienlen CP ,Loeffler J P ,et al . Pharmacological , 脉的收缩。松果体的血管来自于蛛网膜下腔 ,因 molecular and functional characterization of vasoactive intestinal 此该腺体内的血管有三叉神经节来源的神经纤维并 polypeptide/ pituitary adenylate cyclase2activating polypeptide 不奇怪 。支持这点的是将 PACAP 注射进兔血管引 receptors in the rat pineal gland. Neuroscience ,1998 ,85 :887, 20 896. 起了松果体血流的增加。 12. Moller M , Fahrenkrug J , Hannibal J . Innervation of the rat 本实验见到的在切断眼2上颌神经后 ,松果体腺 pineal gland by pituitary adenylate cyclase2activating polypeptide 实质细胞间的神经纤维的消失 ,加上他人的 PACAP ( ) PACAP2immunoreactive nerve fibres. Cell Tissue Res ,1999 , 能够 刺 激 松 果 体 腺 细 胞 分 泌 褪 黑 素 的 实 验 结296 :247,257. 20 ,21,支持三叉神经的感觉神经在松果体内起调 果 13. Liu W ,Fahrenkrug J , Hannibal J , et al . Presence of PACAP2 immunoreactive neurons in the trigeminal ganglion of the sheep : 节褪黑素分泌作用的假说 。但是这种影响的程度尚 Indications for a trigeminal innervation of the pineal gland. 需进一步研究 。 松果体 腺 细 胞 分 泌 褪 黑 素 由 多 个 Annals of the New York Academy of Sciences ,2000 ,921 :340, 神 经 通 路 调 343. 节 ,其中颈上神经节的交感神经支配似乎占主要地 14. Shiotani Y , Yamano M , Shiosaka S , et al . Distribution and 位 。哺乳动物松果体具有来自不同部位的多种肽能 ( ) origins of substance P SP2 , calcitonin gene2related peptide ( ) ( ) CGRP 2 , vasoactive intestinal polypeptide VIP 2and 神经支配 。本文证实三叉神经节 PACAP2IR 神经元 ( ) neuropeptide Y NPY2 containing nerve fibers in the pineal ()的轴突分布到松果体 。本文图 2 见图版 7 gland of gerbils. Neurosci Lett ,1996 ,70 :187,192. 15. Mulder H , Uddman R , Moller K , et al . Pituitary adenylate 参 考 文 献 cyclase activating polypeptide expression in sensory neurons. 1. Reiter RJ . Pineal melatonin :cell biology of its synthesis and its Neuroscience ,1994 ,63 :307,312. physiological interactions. Endocr Rev ,1991 ,12 :151,180. 16. Hannibal J ,Mikkelsen JD ,Clausen H ,et al . Gene expression of 2. Reiter RJ . Melatonin : the chemical expression of darkness. ( ) pituitary adenylate cyclase activating polypeptide PACAPin Molec Cellul Endocrinol ,1991 ,79 :153,158. the rat hypothalamus. Regul Pept ,1995 ,55 :113,148. 3. Vanecek J . 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