精品尿素分解细菌计数细菌计数偏高细菌计数方法土壤
思考: 尿素是人类首次人工合成的有机物，也是一种重要的农业氮肥。1.植物能直接利用尿素吗, 不能。植物是自养生物，利用无机氮源，尿 素是有机物只有当分解成无机物氨后才能被植 物利用。2.土壤中的尿素如何被植物利用, 土壤中的某些细菌能将尿素分解为氨。3.如何
设计
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实验分离出土壤中能分解尿素的细菌,如何对其进行记数,课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、研究思路(一)筛选菌株 1.实例: PCR中耐高温的TaqDNA聚合酶的获 得。 2.实验室中微生物筛选的原理: 人为提供有利于目的菌株生长的条件 (如营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止 其他微生物的生长。(一)筛选菌株 3.本课题使用的培养基配方: 根据物理性质分， KH2PO4 1.4g 该培养基属于哪种 Na2HPO4 2.1g 类型, MgSO47H2O 0.2g 该培养基是如何 选择能分解尿素的 葡萄糖 10.0g 微生物的, 尿素 1.0g 根据用途分，该培 琼脂 15.0g 养基属于哪种类 型,一、研究思路(二)统计菌落数目 1.活菌计数法 原理: 当样品的稀释度足够高时，培养基表面 生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一 个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推 测出样品中大约含有多少活菌。 操作方法: 稀释涂布平板法。 每克样品中的菌株数(C/V)×M(二)统计菌落数目 1.活菌计数法 注意: 恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关 键。为保证结果准确，通常将几个稀释度下的 菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在 30,300的平板进行计数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低， 因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数 来表示。(二)统计菌落数目 1.活菌计数法思考:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种结果。 第一位同学涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 第二位同学涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 哪位同学的结果更接近真实值,这两位同学的实 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学设置了重复组，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。～启示: 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。 在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。(二)统计菌落数目 2.显微镜直接计数 一、研究思路(三)设置对照 目的: 排除实验组中非测试因素对实验结果的 影响，提高实验结果的可信度。(三)设置对照 6思 在做本课题实验时，A同学从对应10 倍考: 稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是 其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50 个菌落。1.A同学实验结果和其他同学不同的原因可能 是什么, (1)土壤样品不同。 (2)培养基配制时混入了其他氮源，或 者培养基被杂菌污染了。2.如何设计实验证明A同学用的土样是否和其他同学相同, 由其他同学用与A同学一样的土样进行实 验。 如果结果与A同学一致，则证明A无误; 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误 或培养基配制有问题。3.如何设计实验证明A同学的培养基是否被杂 菌污染, 将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照。以证明培养 基是否受到污染。(三)设置对照～启示: 实验结果要有说服力，对照的设置必不可少。二、实验操作 (一)土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去 表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事 先准备好的信封中。 取土样用的小
铁铲和盛土样用的信封在使用前都需要灭菌。二、实验操作 (二)制备培养基: 制备牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照) 和选择培养基(以尿素为唯一氮源)。 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。二、实验操作 (三)样品的稀释和接种: 测定细菌的数量，一般选用104、105和 106倍的稀释液进行平板培养。 称取土壤和稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二、实验操作(四)微生物的培养与观察: 将涂布好的培养皿放在30?下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并记录。 本实验使用的平板和试管比较多，在使用前要做好标记。二、实验操作 (五)细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在 30-300的平板进行计数。在同一稀释度 下，至少对3个平板进行重复计数，求出 平均值，并根据稀释度计算出样品中细菌 的数目。三、结果分析与评价(一)培养物中是否有杂菌污染，选择培养基是否筛选出菌落 作为对照空白的培养基在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。三、结果分析与评价(二)样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30-300的平板，说明稀释操作成功。(三)重复组的结果是否一致 如果所有同学选取的是同一种土样，统 计的结果应该相近。
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