【doc】噬菌蛭弧菌Bd—9五种保藏方法的比较研究

【doc】噬菌蛭弧菌Bd—9五种保藏方法的比较研究 噬菌蛭弧菌Bd—9五种保藏方法的比较研 究 第l7卷第4期 2002年12月 大连水产学院 JOURNALOFDALIANFISHERIESUNIVERS兀Y Vo1.17N4 Dec.2002 ? 研究简报?文章编号:1000—9957(2002)04—0341一o4 噬菌蛭弧菌Bd一9五种保藏方法 的比较研究 黄文,杨莉,马志宏 (北京市水产科学研究所,北京100075) 摘要:作者对噬菌蛭弧菌Bdellovibriobacteriovorus的不同保藏方法进行了试验研究,并对 其保藏效果进行了比较,结果表明,5种保藏方法中以冷冻干燥法保藏效果最好,21个 甘油保 月的复活率为100%,其次为4?营养肉汤液保藏法和一20?藏法,l7个月复活率 均为67%. 关键词:噬菌蛭弧菌;保藏;冷冻干燥;甘油;营养肉汤 中图分类号:Q93—336文献标识码:A 噬菌蛭弧菌Bdellovibriobacteriovorus(以下简称蛭弧菌)广泛分布于自然水域,污水 及土壤中,是环境中致病菌自然净化的重要生物因子之一…,且对鱼类致病菌有明显 的裂解作用J.为了进一步探索利用蛭弧菌净化环境,防治鱼病的可行性,对其保藏 方法的研究显得尤为重要.关于蛭弧菌的保藏方法,国外研究报道较少,1963年 Stolp提出了在含有宿主菌细胞的YP琼脂中保藏蛭弧菌,每月转种培养1次的方法; 而对于蛭弧菌在不同保藏条件下的存活时间,各实验室报道结果各异.国内这方面的报 道较少,只有秦生巨’4对蛭弧菌在灭菌自来水,自来水宿主软琼脂及冷冻干燥法保藏 方面做了一些试验.为了探索对蛭弧菌有效,长期,简便的保藏方法,作者选择了从北 京水域中分离纯化的,可同时裂解大肠埃希菌和4种常见鱼类致病菌的蛭弧菌Bd一 9,用5种不同保藏方法对其存活效果进行了观察试验,为进一步将蛭 弧菌应用到 水质净化,鱼病防治的实践中提供科学依据. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1试验材料 宿主菌种中嗜水气单胞菌Aeromonashydropila,由北京市水产科学研究所鱼病室 收稿日期:2001一ll—l2 基金项目:北京市自然科学基金资助项目(6972007) 作者简介:黄文(1974一),男,助理工程师. 342大连水产学院第17卷 提供;施氏假单胞菌Pseudomonasstutzri,肠型点状气单胞菌AeromonaspunctataJlu,or~$一 ceilsintertinalis,由中国科学院微生物研究所提供. 试验用蛭弧菌(简称Bd一9)为作者由北京地区池塘分离,纯化所得.其中,Bd 一 9一SC,Bd一9—98,Bd一9—58分别代表以嗜水气单胞菌,施氏假单胞菌,肠型点 状气单胞菌为宿主菌的蛭弧菌. 稀释液为1/500NB液(即1/500营养肉汤),用经煮沸去沉淀后灭菌的自来水配 制,pH为7.0,7.2. 培养基为1/500NB双层琼脂培养基,底层:20mg营养肉汤,6g琼脂粉,500mL 凉开自来水;上层:20mg营养肉汤,3g琼脂粉,500mL凉开自来水. 脱脂牛奶为市售鲜牛奶,以400Or/rain离心2次,每次20min,虹吸出下层脱脂 奶,经112.6~C高温20min,灭菌后备用.甘油为市售甘油,灭菌后备用. 1.2方法 1.2.1茵悬液的制备 1)宿主菌悬液将宿主菌营养琼脂平板置于25~C恒温箱内培养18,24h后,用无 菌生理盐水洗涤2次,离心后取沉淀,加等量无菌生理盐水制成最终浓度约为5X10m cfu/mL的菌悬液,置于冰箱(4?)中备用. 2)蛭弧菌悬液将适量的蛭弧菌和宿主菌予以融化并保温在55?3mL上层营养 肉汤琼脂培养基试管内混匀,倾注于底层营养肉汤琼脂平板上,摇匀,待凝固后于 25~C温箱内培养24,72h,形成融汇成片的蛭弧菌噬斑,分别加入4mL1/500NB液 (冷冻干燥保存法时加入脱脂牛奶),浸泡30rain后,制成蛭弧菌悬液.为了提高浸泡 效果,可用接菌针于平板划线,增大其表面积. 1.2.2蛭弧茵的保藏方法 1)甘油保藏采用双层琼脂培养成融合斑,用1/500NB制成菌悬液.蛭弧菌悬 液各取1mL,分别加入0.3mL宿主菌悬液和1mL甘油.摇匀后分别置于4~C和一20? 下冰箱保藏. 2)4~CNB液保藏蛭弧菌悬液各取0.5mL,分别加入0.2mL宿主菌悬液于50 mL1/500NB液中,存于冰箱(4?)中. 3)平板保藏对蛭弧菌采用1/500NB双层琼脂培养基扩增培养48h后置于冰箱 (4?)中保藏. 4)冷冻干燥保藏在蛭弧菌呈融合性斑的1/500NB双层琼脂培养基平板中加4 mL灭菌脱脂牛奶并浸泡30min,分装于安培瓶中,每瓶0.2mL牛奶蛭弧菌悬液,0.1 mL宿主菌悬液,塞上消毒棉塞.放入冰箱(一30~C)中速冻2h后,迅速放入冷冻干 燥机中干燥24h.抽真空后用高频真空检测器检测真空,酒精喷灯封口,置于冰箱 (4?)中保藏. 1.2.3蛭弧茵的复活试验以上5种保藏方法(甘油保藏在不同温度下,视为不同的 方法)的蛭弧菌均定期(两个月)进行复活试验,观察保藏效果.蛭弧菌复活试验方 法采用双层琼脂培养法】.试验以同一试验对象(如4~C甘油保藏的Bd一9一SC)3个 第4期黄文等:噬菌蛭弧菌Bd一9五种保藏方法的比较研究343 平行检测平板中的至少两个出现蛭弧菌噬斑为阳性结果;其它为阴性结果. 2结果 2.15种保藏试验的复活结果(表1) 表1蛭弧菌不同保藏方法的活性检测结果 Tab.1AcevityofBdellovibriobacterioruspreservedbydifferentmethods 注:+表不蛭弧菌检铡结果为阳性;一表不蛭弧菌检测结果为阴性. 2.2蛭弧菌5种保藏方法的比较 在不同时间对5种保藏方法进行复活试验,检测蛭弧菌活性.蛭弧菌用4~C自来水 双层琼脂平板保藏可存活3个月,存活率100%;4~C甘油保藏15个月,存活率67%; 4~CNB液保藏15个月,存活率100%,17个月存活率67%;一20~C甘油保藏17个月, 存活率67%,19个月存活率为33%;冷冻干燥保藏蛭弧菌21个月,存活率100%,23 个月仍可存活,存活率为33%. 3讨论 1968年Burger等发现在YP软琼脂中保藏蛭弧菌培养物,蛭弧菌的效价很不稳定. 室温保藏36d后,蛭弧菌的数目由10.pfu/mL减少到10pfu/mL.1987 年秦生巨等] 报道蛭弧菌在灭菌自来水中于4~C冰箱保藏180—240d,大部分菌株不丧失活力.1969 年Huang等报道用脱脂牛奶悬液作保护剂冷冻干燥蛭弧菌培养物,结果很不稳定.本 试验结果表明,从短期保藏来看,以4~C自来水双层琼脂平板保藏最好,不但操作简单 方便,而且复活率达100%.4个月后,培养基严重脱水,变干,无法复活.而从长期 +++++++++++一 +++++++++++一 ++++++++++++ +++一一 ++一一一 ++一一一 ++++++++一一 +++++++++一 +++++++++一 +++++++++一一 ++++++++一一 ++++++++++一 ++++++++一一 ++++++++一一 +++++++一一 ?3579?” 大连水产学院第17卷 保藏效果来看,用4?NB液,一20~C甘油和冷冻干燥保藏均可保藏15个月以上,其中 以冷冻干燥保藏效果最好,存活率高,而且稳定;其次为一2O?甘油和4?NB液保藏 法. 蛭弧菌用4?NB液,一20~C甘油,冷冻干燥保藏法经复活后二次传代,其形态, 裂解宿主菌的特性不变,尽管形成的噬斑数目有不同程度的减少,但仍不丧失活力.其 减少数优于其它保藏方法.保藏前蛭弧菌效价为9×10pfu/mL;4~CNB 液保藏15个月 效价降为10pfu/mL;冷冻干燥保藏17个月效价降为4×10pfu/mL. 此次试验采用同一蛭弧菌,不同宿主菌进行保藏,发现不同宿主菌对实验用的蛭弧 菌Bd一9的保藏时间影响不大,与国外资料介绍的蛭弧菌的存活时间与宿主菌关系密 切有一定的差别,可能与作者分离的Bd一9适应性较广有关. 由于蛭弧菌具有强烈的内源性呼吸作用,在低温条件下又容易死亡,因而对蛭弧菌 的保藏显得比较困难.到目前为止,作者所做的4?NB液,一20~C甘油,冷冻干燥保 藏方法,蛭弧菌的存活时间均已超过15个月,既不用接种传代,又不丧失活性及裂解 宿主菌的特性.这些方法不失为比较简便,有效的保藏方法.而关于宿主菌的存活情况 与蛭弧菌的存活情况有无相互影响,还有待于进一步的研究. 参考文献: [1]司稚东,秦生巨,秋频,等.细菌的寄生菌——噬菌蛭弧菌的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,1982,2(1): 10. [2]马志宏,丁文,杨莉,等.噬菌蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用的研究[J].微生物学通报,1999,260,:408 — 411. [3]STOLPH.Antonievanleeuwenhock[J].JMicrobiolSerol,1963,29:217—248. [4]秦生巨.噬菌蛭弧菌简易保存方法的研究[J].微生物学通 报,1988,15(3):l15一l17. [5]杨莉,马志宏,黄文,等.蛭弧菌对鲤感染嗜水气单胞菌预防效果的 观察[J].大连水产学院,2000,15(4): 288—293. Comparativestudyonfivepreservemethods 0置BdeUovibriobacteriovorus HUANGWen,YANGLi,MAZhi—hong (BeijingFisheriesResearchInstitute,Beijing100075,China) Abstract:BdellvibrioBacteriovoruswaspreservedbyfivemethods.Itwasfoundthatfreezedr- yingwasthebestinthefivekindsofpreservedwayswithrevivalrateof100%intwenty—-one monthperiod.followedby4?nutrientbrothand4? offrostglycerinstoragewithrevivalrate of67%inseventeenmonthperiod. Keywords:Bdellvibriobacteriovorus;preserve;freezedrying;glycerin;nutrientbroth