睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因功能及表达调控研究

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因功能及表达调控研究 福建农林大学 博士学位论文睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因功能及表达调控研究 姓名:陈建秋 申请学位级别:博士 专业:农业生物技术 指导教师:潘大仁 20090401 福建农林大学博士学位论文 中文摘要 睾丸酮丛毛单胞菌(,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,)具有降解许多难降解化合物的 能力，在污染物的生物修复上具有很高的应用价值。但是，该菌对甾类物质的代 谢酶并不是组成型表达的，其表达受到环境中甾类化合物的诱导。因此，该菌对 污染物的消化降解速度很慢，限制了该菌在生物修复中的大规模应用。睾丸酮丛 毛单胞菌中受睾丸酮诱导表达的调节因子称为,,,,基因(,,,,,,,,,,,,(,,,,;,,,,,,,,,,,,,，,,,,)，,,,,基因在类固醇代谢过程中具有十分重要的意义，可以激活或抑制相关代谢酶基因的表达。因此，本研究通过对,,,,基因的克隆及功能分析，从基因转录调控的角度入手，对睾丸酮丛毛单胞菌进行定向调控，提高其降解能力，揭示睾丸酮丛毛单胞菌包括关键酶,,,,,,,,,在内的一系列基因的表达调控机制。该研究对于改造睾丸酮丛毛单胞菌，开发利用睾丸酮丛毛单胞菌进行污染物的环境生物修复等都具有十分重要的意义。研究结果如下: ,(根据已报道的睾丸酮丛毛单胞菌调节因子序列设计引物，从睾丸酮丛毛单胞 菌,,,,, ,,,,菌株中克隆了,,,,基因(,,,,,,,登录号:,,,,,,,,)。序 列分析表明，其核苷酸序列与已发表的,,,,基因(,,,,,,,登录号: ,,,,,,,,)和,,,,基因(,,,,,,,登录号:,,,,,,,,)的同源性分别为,, ,和,,,。保守结构分析表明，该基?虮嗦氲鞍资粲冢蹋酰 易 嫉骺匾蜃樱?,末端含有一个,,, ,,,结合结构域。,(构建了,,,,基因表达载体,,,,,,,,,,,，在大肠杆菌里进行了诱导表达，并 根据重组蛋白的组氨酸特性，利用,,,,,,公司的,,,,,, ,,,, ,,,,,,进行 ,,,,融合蛋白的分离纯化。以分离纯化的,,捩融合蛋白为抗原，制备兔抗 ,,,,多克隆抗体。该抗体特异性良好，效价可达,:,,,,,。,。 以质粒,,,,;,和,,,,为载体，构建了两个,,,,基因重组质粒:,,,,,,,,, 和,,,,;,(,,,,。将重组质粒分别转化或与,,(含,,,,,,,,,基因)共转化 大肠杆菌(,,;,,,,;,,, ;,,, ,,,,,中，酶联免疫吸附实验(,,，,,)测定,,,, 或,,(,,,,,,的表达量。结果表明含,,;强启动子的质粒具有更高的转录活 性;在大肠杆菌中，,,,,基因能够明显诱导,,,,,,,,,的表达。,(构建,,,,基因插入失活突变体的同源重组打靶载体,,,,,，并根据同源重组 原理电击转化野生型睾丸酮丛毛单胞菌，筛选获得睾丸酮丛毛单胞菌,,,,基 因插入失活突变体, ,,,,。应用酶联免疫吸附实验(,,，,,)和高效液相色 谱法(,玎,,,)分别分析了突变体蛋白表达及其降解特性。结果发现突变体 抑制了,,,,基因和关键降解酶,,,,,,,,,的表达，同时突变体丧失了以睾 丸酮作为碳源进行生长的能力。 福建农林大学博士学位论文,(根据同源重组原理，将,,,,;,(,,,,电穿孔转化野生型睾丸酮丛毛单胞菌， 筛选获得睾丸酮丛毛单胞菌,,,,基因高效表达菌,,,,，该菌株已提交中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存号为,,,,, ,,( ,,,,，并申请了一项国家发明专利(专利申请号:,,,,,,,,,,,,,)。,)利用荧光定量,,,检测了,,,,,,,,,和,,,,基因的转录水平。 从荧光定量 ,,,检测的结果来看，睾丸酮均能诱导提高,,,,和野生型菌株,,,,,,,,, 和,,,,基因的转录水平，但同等条件下,,,,基因转录水平要明显高于野生 型菌株。普通,,,,,,结果表明，,,,,在提高,,,,基因表达的同时也能显 著提高关键酶,,,,,,,,,、,(羟基一,(氧戊酸盐醛缩酶(,，,,)和,(羟基戊(,，,( 二烯酸盐水合酶(,,,)的表达，这些酶都与睾丸酮丛毛单胞菌的类固醇代 谢途径有关。,)提取不同培养条件下的,,,,细菌总蛋白，酶联免疫吸附实验(,,，,,)测 定,,,,,,,,,和,,,,的表达量。结果表明，高效表达菌,,,, ,,,,和 ,,(,,,,,,的表达量都得到了提高，,,,,表达量最高可达野生型菌株,,,, 表达量的,(,倍，,,,,,,,,,表达量最高可达野生型菌株,,,,,,,,,表达量 的,,倍。进一步说明构建的高效表达菌,,,,在大幅提高,,,,表达量的同 时，也能显著地提高关键降解酶,,,,,,,,,的表达量。,)根据双向电泳分析结果，从双向电泳凝胶上挖取,,个点，进行 ,,,,，(,,,(,,,,,分析，共有,个蛋白得到鉴定，其中,个点为上调表达， ,个点为下调表达。绝大部分鉴定蛋白都与睾丸酮丛毛单胞菌类固醇代谢有 关。说明加强,,,,表达的高效表达菌,,,,与原始菌相比，能够增加类固醇 代谢酶的表达。,’)对,,,,进行连续传代培养,,代，每隔,代提取细菌总蛋白进行,,,,,,,,, 和,,,,蛋白的表达检测。结果表明:在添加抗生素培养时，,,,, ,,,,和 ,,,,,,,,,的表达均稳定在较高的水平;而不添加抗生素进行培养时，其 ,,汛和,,,,,,,,,的表达起伏较大，总体表达水平比添加抗生素时低。,)利用,,,,和分光光度法对,,,,的睾丸酮和土壤中甾类物质的降解能力进 行分析。结果发现,,,,对睾丸酮和土壤中甾类物质的降解能力均优于野生 型菌株。关键词:睾丸酮丛毛单胞菌，,,，羟类固醇脱氢酶,:碳酰基还原酶，,,,, , 福建农林大学博士学位论文 ,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, , ,,,, ;,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,;,(,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,(，,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,; 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,, ,, ,,,,,,，,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,;( ,), ,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,脚, ,,, ,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,:,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,, , 独创性声明 本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 靴弹必敝储艴揣。,舫、 日期(,,,，; 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 ，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。母, 学位弹必做作者亲笔签名,彬纵 眺。,,(多?多 指导教师亲笔签名: 福建农林大学博士学位论文 第一章文献综述,引言 从上世纪,,年代开始，人们就已经注意到日本东京西郊、英国南部和美国佛罗里达州的野生动物出现了种群数量下降、生殖障碍、发育异常以及雄性个体雌性化等现象。进入,,世纪，越来越多的调查结果表明，人类的生殖障碍、发育异常及某些癌症(如:乳腺癌、睾丸癌和卵巢癌等)与内分泌干扰物的分布水平密切相关(,,,,,,,，,,,,;,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,，,,,,)。科学家指出:“环境内分泌干扰物对人类生殖健康的影响可能是,,世纪人类健康所面临的最大挑战”。美国西奥?科尔伯恩博士也在他的著作《我们被偷走的未来》中大声疾呼:“请别再让癌症掩盖我们的视野了，让我们超越癌症这个范围去认识更多比癌症更可怕的危险信号吧～”(,,,,,,，,,,,)。流行病学资料表明，许多环境化学物质能够模拟或者干扰动物体的内分泌功能，尤其是影响处于发育阶段的哺乳类、爬行类、鸟类以及鱼类。 环境内分泌干扰物进入环境的数量和速度超过了自然净化的速度，破坏了自然动态平衡，使污染物质的积累逐渐占据优势，导致生态功能失调，影响动物、植物、微生物的生长发育及农副产品的产量和质量。环境内分泌干扰物在自然界中反复循环，当农作物或其它生物在摄取了含有这些成分的物质时，随时间推移就会摄入大量的高浓度环境内分泌干扰物。环境内分泌干扰物在非常低的浓度下就能影响动植物和人类的正常生理活动。许多粮食作物都出现了生长异常和品质的下降。这些有害物质残留在农产品上，并通过食物链进入人体从而危害人类健康(赵景联，,,,,)。 环境中内分泌干扰物引发的一系列问题已经引起全世界的广泛关注，尤其是欧美和日本等发达国家政府和国际组织的广泛关注。美国国家环保局(,,,,,)早在,,,,年成立了内分泌干扰物筛选及测定咨询委员会(,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,堍,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,,,,)，对环境中可能的,,,进行筛选和测试(,,,,,,,，,,,,)。欧盟于,,,,年就开展了一项为期三年的,,,,,,,,,,计划，主要是评价欧洲水环境中的,,,，其涵盖很多主题，包括污水监测，评价历史数据，发展体内和体外实验方法，确认现有的模型，影响环境的因素以及毒理学鉴定与评价技术(,，,)的发展 (,,,,:,,,,,(,,,,,,(,,,,,(,,,(;,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)。 在众多的环境内分泌干扰物中，类固醇化合物的干扰活性最强，其主要来自于人体和畜禽的排泄物(,, ,,,, ,, ,,(，,,,,)，另外在土壤中也发现有胆固醇 , 福建农林大学博士学位论文 (,,,,,,,,,,,)、麦角甾醇(,,,,,,,,,,)、,(谷甾醇(,(,,,,,,,,,,)等固醇类化合物(,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)。研究表明，一些人工合成的雌激素排入环境中，会介导生物产生诱导效应，是已经被证实了的一类致癌物质(,,,,,,, ,,, ,,,,,,,，,,,,)。由于类固醇化合物的高稳定性、高活性及存在的普遍性，因此引起了科学家的广泛注意。,,,,年就已经发现有很多微生物(如:诺卡氏菌、假单胞菌、分支杆菌、棒状杆菌和节杆菌等)能够以甾醇化合物作为唯一碳源，进而降解这类物质(,,,,,,,，,,,,)。睾丸酮丛毛单胞菌(,,,,,,,,,,,,,)是革兰氏阴性杆菌，能够以类固醇化合物(如:睾丸酮、胆汁酸等)作为碳源和能源进行生长，最终降解这类物质(,,,,,,, ,, ,,(，,,,,;,,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)。同时，该菌还能降解一些非类固醇类的化合物，如:多环芳烃化合物(,,,,)和苯基链烷酸 (,,,,,,,,,,,,,; ,;,,,)等。该菌也是苯酚和三氯乙烯降解活性最高的细菌(,,,,,, ,,(，, ,,,;,,,,, ,, ,,(，, ,,,;,,,,,,,, ,, ,,(，, ,,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,，, ,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)。对该菌的研究近年来备受加拿大、德国、日本等发达国家的重视。,类固醇化合物,(,类固醇种类及其生物功能 类固醇是广泛分布于生物界的一大类环戊稠全氢化菲衍生物的总称，亦称类甾醇或甾族化合物。这类化合物的结构特点是，都具有由,个六碳环己烷(,、,、,)和一个五碳环(,)组成的稠合四环化合物(甾体母核，图,(,)。绝大多数甾族化合物在,,,和,,,处连有角甲基。各甾族化合物,,,上的取代基不同。 旋 , , 图,,,甾体母核 ,,,(,,, ,,, ,,;,,,, ,, ,,,,,,, 类固醇包括固醇(如:胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇)，胆汁酸和胆汁醇，类固醇激素(如:肾上腺皮质激素、雄激素、雌激素)，昆虫 , 福建农林大学博士学位论文的蜕皮激素，强心苷(如:毛地黄毒苷)和皂角苷配基以及蟾蜍毒等。此外还有人工合成的类固醇药物(如:氢化泼尼松、地塞米松)和口服避孕药等。,(,(,固醇类 固醇类物质在生物界分布甚广，特点是在,,含有一个,(羟基，在,,,连有侧链，有些固醇还有?,双键。动物胚胎组织和皮肤的固醇以及植物的固醇(如:豆甾醇)在侧链上还有一个双键。在生物体内固醇以游离(非酯化形式)或以脂肪酸酯的形式存在。固醇为无色蜡状固体，溶于乙醚、氯仿、苯和热乙醇等有机溶剂，不溶于水，不能皂化(见表,(,)。表,(,中列出某些重要的固醇及其来源。?动物固醇:胆固醇，亦称胆甾醇。脊椎动物细胞的重要组分，在神经组织和肾上腺中的含量最高(湿重百分数)，心脏中含量最低，在肝、肾和皮肤中的含量也相当多。人体内胆石主要由胆固醇构成。胆固醇是细胞膜和细胞器膜的一种组分，它调节生物膜脂质的物理状态，保持膜的流动性。此外，胆固醇还是合成胆汁酸和类固醇激素的前体。?植物甾醇:植物甾醇是植物细胞的重要组分，不能被动物体吸收利用。豆甾醇和谷甾醇都是豆甾烷的衍生物，比胆固醇多两个碳原子，在,,,上有一个乙基。?酵母甾醇:麦角甾醇是酵母菌、麦角菌的主要固醇组分，含,,个碳原子的类固醇化合物。,(,(,胆汁酸和胆汁醇 胆汁酸和胆汁醇是哺乳动物和其他脊椎动物体内胆 固醇的降解产物。较高等的脊椎动物(哺乳类、鸟类、蛇)胆汁内都含,,,胆汁酸，与牛磺酸或甘氨酸形成结合物胆汁盐。低等原始脊椎动物的胆汁内含,,,胆汁酸或,,,或,,,胆汁醇，有些与硫酸形成酯，也有些与牛磺酸形成结合胆汁盐。胆汁盐的生理功能是分泌到肠内促进脂质的乳化与吸收。某些肝脏疾病和阻塞性黄疸导致胆汁分泌减少影响脂质的消化吸收。 表,(,固醇的主要种类和分布情况 ,,,,, ,—, ,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, , 福建农林大学博士学位论文 ,(,(,类固醇激素 类固醇激素包括肾上腺皮质激素和性激素。肾上腺皮质激素由肾上腺皮质分 泌产生。其生理功能主要表现在两个方面: (,)调节糖代谢:抑制糖的氧化，使 血糖升高，促进蛋白质转化为糖;(,)调节水盐代谢:促使体内保留钠离子及排出 过多的钾离子，调节水盐代谢。性激素可分为雄性激素和雌性激素两类。它们与 动物的性别及第二性征的发育有关。由于类固醇激素的特殊生理功能，因此具有 重要的药用价值。类固醇激素主要应用在以下几个方面:?抗炎和抗过敏:多?掷喙檀 粜阅埽 纾禾烊坏目傻乃桑ǎ保罚 腔 保保 亚?技に鼐哂杏帕嫉目寡缀涂构 皮质酮)和氢化可的松(,,(羟基皮质酮)是广泛使用的抗炎和抗过敏药物。? 治疗男性或女性疾病和避孕:性激素常用于男性或女性疾病的治疗。例如雌二醇和黄体酮可用于治疗女性的月经失调，以及妇女更年期疾病等。黄体酮还有安胎作用，使妊娠过程能够正常进行。?改善代谢功能:许多类固醇激素都有良好的调节糖代谢和水盐代谢的功能。特别是一些人工合成的类固醇激素，作用更显著，如斯坦唑(,,,,,,,,,,)。,(,类固醇激素在环境中的迁移转化 释放到环境中的类固醇激素除与水体混合外，还经历悬浮物、沉积物或土壤的吸附、生物降解和光降解等过程，这些过程直接影响着类固醇激素在环境中存在状态及其生态和毒理效应。下面就类固醇激素在环境中的迁移转化进行说明。,(,(,吸附 在类固醇激素的环境行为中，类固醇在水相和固体颗粒间的吸附与分配，是影响类固醇环境命运的重要因素之一。水相中的类固醇激素可以结合到固体悬浮颗粒上，但是结合率低，只有不到,,的雌二醇、孕酮结合到固体悬浮颗粒上或活性污泥上(,,,,,,,, ,,,,(，,,,,;,,,,,,,, ,,,,(，,,,,)。常用线性吸附方程(线性吸附和,,,,,,,,;,吸附)来描述疏水性有机物在固液界面的分配规律(杨诗家，,,,,)。对睾酮、雌激素、雌酮、雄烯二酮在土壤中的吸附和去吸附机理已经进行了深入研究(,,, ,,,,(，,,,,)。,,、,,和,,,等物质的吸附可用,,,,,,,,;,吸附等温线来描述，三种物质在沉积物上吸附系数大小顺序为,,,,,,,,,(,,,,,甜,,(，,,,,;,,,,, ,, ,，(，,,,,)。但在污水初级处理中，雌激素化合物活性污泥吸附呈线性吸附规律，其去除率为,,(,,,(,,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)。 对于疏水性类固醇激素，有关影响其在固液界面吸附规律的研究很多，主要集中在天然有机物、离子强度、,,和矿物质影响等几个方面。矿物质对类固醇类激素的吸附也有作用，纯氧化铁对类固醇激素的吸附量是含,(,,,,,沉积物吸附量的,,,;而且颗粒的大小和有机碳含量也能影响吸附过程(,,, ,, ,,(， , 福建农林大学博士学位论文,,,,)。雌二醇和睾酮能够与土壤颗粒中有机质强有力的结合，从而在土壤水中不溶解或者不转移，而溶解性有机质的存在会使,,和,,分配系数减少,,,,,,,(, ,,,, ,, ,,(，,,,,)。活性污泥对雌激素的吸附与,,值有关(,,,,, ,, ,,(，,,,,)，雌二醇的溶解与溶液的离子强度有关(,,, ,, ,,(，,,,,)，同时土壤中阴离子表面活性剂可以增加雌激素的不可逆吸附(王联芝等，,,,,),(,(,生物降解 ,,,,,,,,,,和,,,,,;,,是最早发现微生物能够转化甾体化合物的科学家。,,,,年,,,,,研究了胆酸和甾醇类化合物的分解代谢过程。从,,世纪中期，陆续发现许多微生物能够以各种类固醇底物.