十字花科植物转基因技术研究进展及存在问题

十字花科植物转基因技术研究进展及存在问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 十字花科植物转基因技术研究进展及存在 问题 一 /D 吉林农业太学1996,18(1):96~102 dtmr~alJginAgric'ultura~Unb,ersit~ 十字花科植物转基因技术研究 进展及存在问题 ? 用音张智奇王少鸥钟维瑾 (上海蒂夏五_学栽培研究所上海201106) 绍二主蓑科问银酝关键调转化受体转化方法,苎茎凰擅芝??焦.纠扛?\中圉分类号-3, AdvancesendProblemsOntheStudyofTransgenicTechniqueofCrciferae ZhouYjneta1. (,如ofCropBreed~ffultitmtionShanghaiAcademyofA9ri..) AbstreetAdvancesandproblemsOnthesmdyoftransgenictechniquesuchas transformationexplant,transformationmethod,ttansgeneandtranshenicplantsof cruciferaewererepresentedinthispaper?. Keywords:transformationexpbnt;transformationmethod;transgenicplant;Cru— ciferae 十字花科(crueiferae)植物中包括许多重要的蔬菜,花卉,油料和饲料作物,在人民生 活及农业生产上有着重要意义.应用常规方法进行育种已取得很大成功.为了克服种间 的界限,进一步改良十字花科作物品质,提高抗逆性,植物基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术做为新的育种手 段,得到了广泛重视,近10年来,研究进展很快.自1985年Ooms获得转基因油菜植物以 来,美国,加拿大,法国,日本,中国"等国的科学家,相继从甘蓝型油菜,拟 南芥,甘蓝,羽衣甘蓝,花椰菜,大白菜,黑芥等近10种十字花科植物的不同转化受体,通 过间接转化或直接转化方法,得到了转基因植物美国农业部在1994年已批准转基因油 莱进入市场.此外,在转化受体,转化方法,外源基因的导入及转基因植株获得等方面的研 究都有很大进展.本文拟从上述几个方面介绍十字花科植物基因工程研究进展及存在的 ?收精日期t1995-09-08 第l8卷第l期周音等:十字花科植物转基因技术研究进展及存在问题 问题. 1十字花科植物基因工程研究进展 1.1获得转基因植物的转化受体 1985年Horsh[.等首次创用叶盘法转化烟草,其后不但叶盘法在许多作物转化上广 泛采用,而且转化所用的外植体(转化受体)种类也不断扩大.十字花科植物的转化受体主 要是赢接取自植物的组织块,包括无菌苗的下胚轴,子叶,叶,根和发芽种子等,以及大田 植株花茎的切段和薄层细胞.其优点是进行转化简便,快速.缺点是:?它们是多细胞结 构,再生植株可能是嵌合体,但可通过原生质体转化解决.现已从甘蓝型油菜,黑芥的原生 质体获得再生转基因植株["…?这些转化受体是二倍体,因而转化植株常是杂合 的,后代会发生分离.如果用具备了单倍性组织和单细胞两个特性的小孢子,可得到再生 纯合二倍体.我们对甘蓝型油菜小孢子进行培养,通过诱导胚状体高频率得到再生植株, 为进—步基因转化提供了依据. 1.2转化方法 基因导入植株的方法为赢接导入和间接导入. 1.2.1问接转化法用于植物遗传转化的常用农杆菌有发根农杆菌(Agrobcteriumrhi — zogenes)和根癌农杆菌(A.tumefaciens).它们能分别把Ri和Ti质粒中的一段DNA(T— DNA)转移并插入到植物细胞的染色体基因组中十字花科植物是农杆菌的良好宿 主[".但不同类型的根癌农杆菌菌株转化能力有所差异,胭脂碱型(nop~ Une)强于章鱼碱型(octopine)["..".这种差异主要是由Ti质粒上的f区基因对 这些植物伤口细胞分泌的信号物质不太敏感口o2.发根农杆菌存在类似现象,一般是农杆 碱型(agropine)强于甘露碱型(mannopine)[]."_2B],原因可能是被它们转化的植物细胞对生 长素的敏感性不同. 外植体与根癌农杆菌共培养是获得转化植株的主要途径( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1)通过原生质体与根 癌农杆菌共培养已在甘蓝型油菜和黑芥得到了转基因植株,白菜型油菜得到了转化的愈 伤组织研究发现,加入根癌农杆菌的最佳时间随物种的不同而有差异.甘蓝型油菜与烟 草相似,以在原生质体开始培养后第3天时加入为好[3{].白菜型油菜是在原生质体开始 培养时即加入,这可能是因为其原生质体分裂开始得较早[2{].一般认为在原生质体开始 第一次分裂时加入比较容易发生转化. 1.2.2直接转化法植物基因直接导入技术是一种不需借助载体而把带有目的基因的 原生质体DNA或基因赢接导入植物体或离体细胞,组织的器官中的一种基因工程技术. 该技术方法简单目达到了转化的目的.在十字花科植物上取得成功的方法是PEG法,电 击法,显微注射法,见表2. 吉林农业大学1996芷 表1 Ta"b1.Trarmformsl~onofcn~ifere,ouIine-gb-c帅andmleeneraUonoft]ransgeni~plants 注:At:根癌农杆菌Agn~mctcriumtumcc他Arl发根农杆菌Asro~cteTJmnTbJzogcncs 第18卷第l期周音等:十字花科檀物转基因拄术研究进展及存在问胚5}9 PEG法的特点是不需要特定的仪器设备.结果也较稳定.用这种方法现已从甘蓝型 油菜原生质体获得再生转基因植株,从黑芥,芜青,拟南芥菜原生质体获得转化愈伤组 姐['.. 1987年Guerehe等用电击法转化了甘蓝型油菜,他们共处理了4×10个原生质体, 筛选到21个抗性克隆.最终仅分化出2棵转化植株,形态和育性都完全正常.显微注射法 不受细胞壁的限制,转化效率比较高.并且不需要特定的选择系统.这在应用上具有意义. 用该方法从甘蓝型油菜花粉胚获得转基因植株,从原生质体获得转化的愈伤组织. 此外,其它一些直接转化方法在十字花科植物上也有所探索.如Hussain等用脂质体 法成功地把花椰菜花叶病毒导人到芜青原生质体中.Weber等用激光脉冲在甘蓝型油菜 的细胞壁,细胞膜和叶绿体,外膜上穿一小孔,外源DNA可由此进入细胞或细胞器. 1.5最高转化频率 转化频率是评价各个作物转化技术成熟程度的主要标志之一.从十字花科植物的最 高转化频率来看,多数已达到50左右,如油菜55,芥蓝83.拟南芥菜100,羽衣甘 蓝44.这与十字花科作物组织培养基础较好有关.即其外植体再生植株的频率较高.转 化系统虽已在笥吩十字花科植物上建立,转化率相对较高于其它作物.但从总体上看,由 100吉林农业大学1996拒 于转化受体不同,同一作物的转化频率差异很大,结果也不稳定.因此,建立高效重复性高 的转化系统仍是今后研究的重要课题.目前外源基因插入植物基因组是一个随机过程,有 可能影响其它性状.所以当获得高效转化后,则可筛选具有优良性状,且保留原有优良性 状的基因工程植株 1.4向十字花科植物导人的外源基因和转基因植株的获得状况 在植物基因工程研究中.将外源基因导入植物井获得转基因植株的目的是:(讨植 物基因调控机理,充实发展植物分子遗传学基础理论.?对受体植物进行遗传改良.获得 新品种为生产实践服务.根据以上目的,迄今为止向植物导入的外源基因可以分成两大 类:一类为标志基因,用于跟踪探讨调控规律.另一类为目的基因,即符合遗传改良目的的 基因 标志基因的表达产物容易检测,便于追踪基因的表达过程和筛选被转化细胞已被导 入十字花科植物的标志基因主要是新霉素磷酸转移霉基因(NPTl1),能使受体细胞获得 卡那霉素抗体,从而便于筛选转化细胞;其次是潮霉素磷酸转移酶基因,能赋予潮霉素抗 性,便于转化细胞的筛选.二氢叶酸还原酶基因在十字花科基因转移中也有所应用?它可 使转化细胞产生对氨甲喋呤的抗性目前已测定的十字花科植物均含有高水平的内源 CAT活性,如甘蓝型油菜,花椰菜,芥菜,黑芥等….这使CAT(氯霉素乙酰转移酶)基 因的应用效果受到极大影响.至今只有1篇文献报道用极低浓度的氯霉索筛选到一些抗 性植株,且其中只有一半是真正被转化了的. 目前,以遗传改良为目的而导入十字花科植物基因有:来自苏云金杆菌的B.t一基 ,它能赋予受体植物抗虫性;能控制乙烯生物合成的S一腺苷蛋氨酸酶(SAMase)功 能基因汹],它能防止或延迟花序衰老;抗Glufosinate除草剂的酰基转移酶基因(bar)等. 已被导入基因的十字花科植物有近10种,有甘蓝型油菜,拟南芥,甘蓝,羽衣甘蓝,花揶 菜,芥蓝,芥菜,大白菜,黑芥.欧洲1990年批准转基因油菜进行田问试验,美国农业部 1994年批准转基因油菜(含有丰富的月桂酸酯,用于制肥皂,去污剂和洗发液)投入市场. 2十字花科植物基因工程的存在问题 2.1细胞培养和分化诱导技术有待进一步提高 细胞转化技术的成功在很大程度上依赖细胞分化诱导技术,细胞分化诱导技术的建 立是基因工程能否开展井走向实用化的关键环节之一虽然,转化系统已在部分十字花科 植物上建立,但从整体上看,转化效率仍然不高,结果也不太稳定,尤其是转化成功的植株 材料不多因此,对尚未建立良好转化系统的十字花科植物,如青菜,鸡毛菜等,还需 要进 一 步研究,探索.确立重复性好的细胞培养和分化诱导条件仍是今后工作的重点. 2.2转基因植株与昆虫抗药性 最近美国人实验证明,经12次繁殖后,昆虫便对苏云金杆菌霉蛋白产生抗性,如甲虫 经繁殖l7代后,抗药性增加2000倍,故要不断研究新的抗虫基因和新的杀虫技术.由于 十字花科植物中大多数是人类可食的蔬菜,昆虫抗药性的提高,势必使蔬菜农药残留量增 加,将影响蔬菜的可食性. 综上所述,十字花科基因植物的研究近10年来取得了长足进展,但还有不少问题值 tj?lr,, 第18卷第1期周音等:十字花存在问题iOl 得进—步探讨.尽管如此,其应用前景仍是十分广阔的. 参考文献 1何玉科.发根土壤杆菌在芸墓作物上的高效遗传转化.西北农业大学t1989,17(41;1 2何玉科.甘蓝RjT-DNA转化根的檀株再生.生物工程,1990?6(2)120 3何玉抖芸薹属作物在发根农杆菌介F的最适转化条件.西北农业大学,1990t18(2):18 4蒋兴村荨甘蓝畸胎瘤的诱导及TDNA的转移.科学通报.1984,13=814 5蒋兴村等.植物基因工程研究的潜在受体一甘蓝.遗传t1986,13(1):们 8程振柬等.根癌农杆菌对甘蓝董油菜的转化及转基因檀{朱的再生植物,1994?36(9):657,668 7毕学军等.B日d?thuringiemis杀虫基因在花椰菜愈伤组织的整合与表达中国农业科学,1992,25(4):82, 87 8BirotAMmaLPlantPhnBiochem.1987,25}323 9CharterPJctal,PtCellReports.1989.71628 10Ctmce~tPJetnPlantCellReports.1989,8|303 11Char髓tPJct.The.co.A0pbGenet.1988,75{438 l2喇Ccte3.C~netict~ormationofCauliflowerBrme3cao~ragcaLm附rytisbyAgro~~tcciumrhizoge— n?.PLantCcURe.ports.1988.7:88,91 13D哪mBmaLEffie3~nttransfornatkmofArabidoo~isthtLllar~in8dh删getrax~rtoprl捆tMGG? 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