食管癌引流区淋巴结细胞裸鼠体内抑瘤实验

食管癌引流区淋巴结细胞裸鼠体内抑瘤实验 食管癌引流区淋巴结细胞裸鼠体内抑瘤实 验 食管癌引流区淋巴结细胞裸鼠体内抑瘤实验 国建飞,杨立伟,高志明,何明,白世祥,施靖 ? 1551? ? 论着? 【摘要】目的观察肿瘤引流区淋巴结(TDLN)细胞对自体瘤细胞体内杀伤作用. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 将TDLN细胞分为3 组进行培养:TDLN—I组培养基中添加IL一2,TDLN一?组添加IL一2+IL一4+粒一单核细胞集落刺激因子(GM— CSF),TDLN—HI组添加IL一2+IL一4+GM—CSF+自身食管癌细胞抗原(tAg).选择60只BALB/C裸鼠,用术中切 取的食管癌组织块建立荷瘤裸鼠模型,将裸鼠随机分为空白对照组,lL一2组,TDLN—I组,TDLN一?组和TDLN一 ?组,各6只,分别给予0.9%氯化钠注射液,IL一2及相应TDLN细胞.每周测量并记录一次裸鼠的肿瘤体积,5周 后处死裸鼠取出移植瘤标本,用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率.结果实验的不同时间5组裸鼠肿瘤体积间差异有 统计学意义(F=30.020,P<0.01).进一步分析显示:空白对照组与IL一2组肿瘤体积间差异无统计学意义(P> 0.05):实验进行3,4,5周时TDLN—I组,TDLN—il组及TDLN—II组肿瘤体积均较空白对照组及IL一2组显着降 低,差异均有统计学意义(P<0.01);TDLN—I组与TDLN一?组间差异显着(P<0.05).各组肿瘤细胞凋亡率间差 异有统计学意义(P<0.01),TDLN一?组的肿瘤细胞凋亡率最高为(39.1?1.5)%. 结论TDLN细胞在体内具有杀 伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的功能,可以作为一种新的治疗肿瘤的有效手段. 【关键词】食管肿瘤;肿瘤引流区淋巴结;树突细胞;淋巴细胞 【中图分类号】R735.1【文献标识码】A【文章编号】1007—9572(2010)14—1551—03 基金项目:河北省普通高等学校强势特色学科肿癌学建设经费资助项目(冀教高[2005]52号);河北省医学科学研究重点课 题(20090519) 作者单位:054000河北省邢台市,邢台市人民医院(国建飞);河北医科大学第四医院(杨立伟,何明,白世祥,施靖);河北 省新乐市中医院(高志明) 通讯作者:杨立伟,050011河北省石家庄市,河北医科大学第四医院;E—mail:ylwl911@yahoo.corn.cn 2004年通过观察MSA—P患者壳核后部GE序列T2WI,发现 壳核后部低信号在诊断中有较好的敏感度.壳核信号改变很可 能由萎缩的壳核和外囊形成组织间隙导致,或者由铁沉积和反 应性小胶质细胞增生以及星形胶质细胞增生导致. 总之,要区分MSA各型很难,但可以通过构音障碍,共 济失调步态,跟膝胫试验阳性,指鼻轮替试验障碍,步态异 常,肌张力增高6个方面临床表现的特异性,加上MRI特征 如壳核外侧缘高信号,壳核后外侧低信号,以及侧脑室扩大及 四脑室扩大,小脑萎缩,脑干萎缩,壳核萎缩等影像学改变, 来诊断MSA及鉴别其分型. 参考文献 1GrahamJ,OppenheimerD.Orthostatiehypotensionandnicotinesensi— tivityincaseofmultiplesystematrophy[J].JNeuralNeumsurgPhy— ehiatry,1969,32:28—34. 2GilmanS,LowPA,QuinnN,eta1.Coneensusstatementonthediag- nosisofmultiplesystematrophy[J].JNeuralSci,1999,163(1): 94—98. 3InoueM,YagishitaS,RyoM,eta1.Thedistributionanddynamic densityofoligodendmglialcytoplastieinclusions(GCIs)inmultiplesys- ternatrophy:acorrelationbetweenthedensityofGClsandthedegreeof involvementofstriatonigralandolivopontoeerebellarsystems[J].Acta NeuropatholBed,1997,93:585. 4吴江.神经病学[M].北京:人民卫生出版社,2005:305— 3o9. 5ShojiM,HarigayaY,SasakiA,eta1.AccumulationofNACP/M— phasynueleininLewybodydiseaseandmultiplesystematrophy[J].J NeuralNeumsurgPsychiatry,2000,68:605. 6NakaH,OhshitaT,MurataY,eta1.CharacteristicMRIfindingsin multiplesystematrophy:comparisonofthethreesubtypes[J].Neuro- radiology,2002,44(3):204—209. 7BronneisC,EggerK,SeherflerC,eta1.Pregressionofbrainatrophy inmultiplesystematrophy:alongitudinalVBMstud),[J].JNeurol, 2007,254(6):191—196. 8HorimotoY,AibaI,YasudaT,eta1.LongitudinalMRIstudyofmul— tiplesystematrophy—whendothefindingappear,andwhatisthe course.'?[J].JNeurol,2002,249(7):847—854. 9WatanabeH,FukatsuH,HishikawaN.eta1.Fieldstrengthsandse— quencesinfluenceputaminalMRIfindingsinmultiplesystematrophy [J].JNeurology,2004,54(4):671—672. (收稿日期:2010—01—12;修回日期:2010—04—14) (本文编辑:刘莉) ? 1552? InVivoTumor—inhibitioninEsophagealCancerCellsinNudeMiceGUOJian— fei,YANGLi—wei,GAOZhi—ming, eta1.PeoplesHospitalofXingtaiCity,Xingtai054000,China 【Abstract】objectiveTostudyinvivotumorinhibitioneffectsontumor— draininglymphnodes(TDLN)cellsin nudemice.MethodsTDLNmicewereculturedin3groups:IL一 2wasaddedtotheculturemediuminTDLN—Igroup,IL 一 2+II+GM—CSFinTDLN—IIgroup.IL一2+IL一4+GM—CSF+tAginTDLN一? group.Themiceweredividedran— domlyintogroupsblankcontrol,IL一2,TDLN—I,一11,一 llI,whichwereinjectedwithNS,IL一2,TDLNcells,re— spectively.Tumorvolumeofnudemiceweremeasuredandrecordedonceperweek.Micewer esacrificedtoremovetransplanted tumorsamplesandtumorcellapoptosisdetectedbyflowcytometry.ResultsTherewassignifi cantdifferenceintumorvolume between5groupsatdifferenttimeofexperiment(F=30.020,P<0.01).Afurtheranalysissh owedthatnosignificantdiffer- eneewasnotedintumorvolumebetweengroupscontrolandIL一 2(P>0.05).TumorvolumedecreasedingroupsTDLN—I, II,111ascomparedwithgroupscontrolandIL一 2,thedifferencewassignificant(P<0.O1),andTDLN,1weresignificant— lydifferentfromTDLN一? (P<0.05).Therewassignificantdifferenceintumorapoptosisratebetween5groups(P(0. O1), theapoptosisratewasthehighestinTDLN一?group(39.1? 1.5).ConclusionTDLNcells,havingfunctionsofaiti—tumor cellsandinducingtumorcellstoapoptosis,canbeusedasaneweffectivemethodtotreattumor s. 【Keywords】Esophagealneoplasms;Tumor— draininglymphnodes;Dendriticcells;Lymphocytes 肿瘤的细胞过继免疫治疗13益受到重视.成熟的树突状细 胞(dendriticcell,DC)是体内功能最强的,最有效的抗原递 呈细胞.肿瘤引流区淋巴结(tumor—draininglymphnode, TDLN)含有丰富的淋巴细胞,由于其特殊的位置,又含有较 多的已摄取肿瘤抗原的树突状细胞,TDLN可以成为一种较好 获得的对肿瘤细胞有很强杀伤作用的淋巴细胞潜在来源.本研 究通过建立人食管癌裸鼠模型,探索TDLN在体内对食管癌细 胞的杀伤作用. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物SPF级BALB/C裸鼠30只,3—4周龄,体 质量14—17g,雄性,购于中国医学科学院动物中心,实验动 物质量合格证明号是48678.饲养室内恒温,恒湿,定期紫外 线照射,鼠笼,垫料,饮水,饲料均高压消毒. 1.1.2肿瘤标本取自河北医科大学第四医院胸二科食管中 段癌手术患者,男性,65岁.临床病理分期:T3N,M.,中分 化鳞状细胞癌.术前未行放,化疗. 1.1.3TDLN细胞术中取同一患者TDLN制成细胞悬液培养 7d获得. 1.2方法 1.2.1TDLN细胞的培养和食管癌细胞抗原的制备手术时 无菌摘取2,3个无明显转移的淋巴结,用D—Hanks液冲洗 并去除结缔组织和脂肪组织后,剪成1mm大小的组织碎片, 200目钢网过滤,悬于30mlRPMI1640培养基.将TDLN细胞 分为3组进行培养,TDLN—I组培养基中添加IL一2,TDLN 一 ?组添加IL一2+IL一4+粒一单核细胞集落刺激因子(GM — CSF),TDLN一?组添力?IL一2+IL一4+GM—CSF+自身食 管癌细胞抗原(tAg),置于37oC,5%二氧化碳(CO)培养 箱培养,具体方法参见文献[1]. 1.2.2人食管癌裸鼠移植瘤模型的建立手术时无菌切取部 分食管癌组织块,用0.9%氯化钠注射液冲洗后切成近1mm 大小,植入裸鼠腋背部皮下,具体方法参照文献[2]. 1.2.3动物模型的分组及处理依移植瘤体积大小编号,采 用随机数字表法将动物模型分成5组:空白对照组,IL一2 组,TDLN—I组,TDLN一?组,TDLN—m组.每组6只裸 鼠.1周后治疗(瘤体大约30IBm,淋巴结细胞进入对数生 长期):空白对照组每只裸鼠局部注射0.9%氯化钠注射液0.2 ml;IL一2组每只裸鼠局部注射1000U/ml的IL一20.2ml; TDLN—I组,TDLN—II组,TDLN一?组每只裸鼠局部注射 效应细胞(TDLN细胞)2×10/ml0.2ml以及1000U/ml的 IL一20.2ml.以后,空白对照组裸鼠每周局部注射0.9%氯 化钠注射液0.2ml,其他各组裸鼠每3d局部注射1次IL一2 0.2ml(1000U/m1).每周用游标卡尺测量并记录肿瘤长径 (a),短径(b),按体积(V)=axab/6计算肿瘤体积.根据 肿瘤体积的变化描绘各组的肿瘤生长曲线,并计算抑瘤率,抑 瘤率(%)=(1一(实验组结束瘤体积一实验组开始瘤体 积)/(空白对照组结束瘤体积一空白对照组开始瘤体积)] ×100%.5周后脱颈处死裸鼠取出移植瘤标本. 1.2.4流式细胞仪检测移植瘤的肿瘤细胞凋亡率将瘤块用 70%的乙醇固定,制成单细胞悬液,采用流式细胞仪检测肿瘤 细胞凋亡率.具体方法按说明书进行. 1.3统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行统计分析. 计量资料以(?s)表示;各组间是否有统计学差异采用 GeneralLinearModel中RepeatedMeasures进行统计检验;如有 统计学差异,每周各组问采用One—wayANOVA进行统计.P <0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1本组30只裸鼠食管癌移植瘤成活率为100%. 2.2裸鼠移植瘤体积变化GeneralLinearMode1分析显示, 实验的不同时间5组裸鼠移植瘤体积变化间差异有统计学意义 (F=30.020,P<0.01);且实验进行3,4,5周时,TDLN— I组,TDLN一?组和TDLN一11I组裸鼠移植瘤体积与空白对照 组及IL一2组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);实验 进行3周及5周时,TDLN一?组裸鼠移植瘤体积较TDLN—I 组显着降低',差异有统计学意义(P<0.05,见表1). 2.3各组裸鼠的抑瘤率TDLN各组裸鼠的肿瘤抑瘤率大于 ChineseGeneraIPrae!!~e 妻}5是誊薰3篱鼍纂诵 IL一2组,且TDLN—m组抑瘤率最高(见表2). 2.4各组肿瘤细胞捌亡率比较空白对照组,IL一2组, TDLN—I组,TDLN—I/组,TDLN—m组肿瘤细胞凋亡率分 另4为(7.1?3.0)%,(12.4?1.2)%,(27.6?2.0)%, (33.1.4-4.5)%和(39.1-4-1.5)%,组问差异有统计学意义 (F=153.314,P<0.01);且各组肿瘤细胞凋亡率问两两比 较,差异均有统计学意义(P<0.05). 表1实验的不同时间5组裸鼠移植瘤体积变化(?s,him) Table1Thetransplantationtumorvolumeoffivegroupsfromweek1to week5 组别只数1周2周3周4周5周 注:与空白对照组比较,P<0.Ol;与IL一2组比较,P<0.01;与 TDLN—I组比较,P<0.05 表2各组裸鼠抑瘤率(%) Table2Inhibitionratiooftransplantationtumoroffourgranps 注:一表示1周时无结果 3讨论 TDLN细胞含有丰富的淋巴细胞和树突状细胞,由于其特 殊的位置,淋巴细胞受到树突状细胞递的肿瘤抗原致敏,对 肿瘤细胞具有特异性杀伤作用J.但在患者体内,肿瘤细胞 通过免疫抑制和免疫逃逸机制,致使肿瘤抗原不能得到有 效的提呈,T淋巴细胞介导的免疫应答不能被有效激活J. 本实验采取体外培养TDLN细胞的方法,消除免疫抑制性 细胞因子的影响,使树突状细胞能够有效地递呈抗原,T淋巴 细胞能够被有效地激活,主要通过CD[T细胞的分泌型杀伤作 用和非分泌型杀伤作用杀伤肿瘤细胞.另外,TDLN细胞中的 cD细胞对肿瘤细胞具有非特异性杀伤作用. TDLN细胞容易获得,手术时摘取即可,需要从外周血 或肿瘤组织中提取,而且TDLN内淋巴细胞含量丰富,经培养 完全能达到临床使用的数量,不像淋巴囚子激活的杀伤细胞 (LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)提取获得的增殖细 ? 1553? 胞数量较少,同时它还含有较多的已摄取肿瘤抗原的树突状细 胞及少量自然杀伤细胞(NK细胞)等.食管癌TDLN细胞经 体外培养后可以得到大量T细胞和成熟树突状细胞,IL一2是 淋巴细胞体外增殖的必备条件,在培养基中添加GM—CSF 和IL一4能得到更多的成熟树突状细胞..有人认为自体肿 瘤抗原致敏的树突状细胞,和TDLN细胞共同培养后,具有更 强的杀伤作用.本实验结果显示,TDLN—m组与TDLN一 ?组裸鼠移植瘤体积以及抑瘤率间无显着差异,说明TDLN中 的树突状细胞已获取肿瘤抗原,无需再次致敏,体外培养完全 可以使其恢复活性. 本研究结果还显示,TDLN—I,?,?组肿瘤细胞凋亡 率均显着高于IL一2组和空白对照组,表明TDLN细胞可促进 食管癌细胞凋亡,其中TDLN一11I组肿瘤细胞凋亡率最高, TDLN一?组次之,TDLN—I组最低,表明经自身肿瘤抗原刺 激后,TDLN细胞具有更强的促进肿瘤细胞凋亡的作用. 综上所述,TDLN细胞在体外培养后回输体内可以获得有 效杀伤肿瘤细胞的作用;TDLN细胞能诱导肿瘤细胞凋亡. TDLN细胞由个体肿瘤直接致敏,具有特异性,培养TDLN细 胞回输人体有可能作为一种有效的个体化抗肿瘤免疫治疗新方 法.但TDLN细胞是通过何种途径诱导肿瘤细胞凋亡的,尚待 进一步研究. 参考文献 1李肩亮,单保恩,张超,等.不同刺激剂诱导肺癌患者引流淋巴 结细胞分泌细胞因子的研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2006, 22(5):609—612. 2何明,单报恩,李启亮,等.肺癌淋巴结细胞培养及体内外的杀 伤作用[J].中华实验外科杂志,2006,23(3):359—361. 3CarriereV,ColiddonR,Jiguet—JiglaireC,eta1.Cancercellsregu— latelymphocyterecruitmentandleukocyte—endotheliuminteractionsin thetumor—draininglymphnode[J].CancerRes,2005,65(24): l1639—1l648. 4KacaniL,WurmM,SchennachH,eta1.Immuno—suppressive effectsofsolublefactorssecretedbyheadandnecksquamouscellcarci— nomaondendriticcellsandTlymphocytes[J].OralOncol,2003, 39(7):672—679. 5CohenPA,PengL,KjaergaardJ,eta1.T—celladoptivetherapyof tumors:mechanismsofimprovedtherapeuticperformance[J].Crit RevImmunol,2001,21(13):215—248. 6金鹰,唐玫,李国明.实用淋巴细胞培养技术[J].激光生物学 报,2000,9(3):75—78. 7李秋平.细胞因子与树突状细胞分化诱导[J].外医学肿瘤学分 册,2004,31(10):742—744. 8SabelMS,AroraA,SuG,eta1.Adoptiveimmunotherapyofbreast cancerwithlymphnodecellsprimedbyeryoablationoftheprimarytumor [J].Cryobiology,2006,53(3):360—366. (收稿日期:2009—12—16;修回日期:2010—04—16) (本文编辑:刘莉)