彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性研究

彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性研究 Vol . 10 ,No . 6 第 10 卷第 6 期生 物 技 术 2000 年 12 月 B IOTECHNOLOGY Dec ,2000 () e IgY 是为了有效去除脂类 ,防止在提纯 样用重氮苯地将 hIHN 1 - 26Gly. Tyr 与其它 载体蛋白连接而成 ,而在本实验采用抗原肽 保存过程中腐败变质 。间接 EL ISA 的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 结 包被 。一般来讲 ,由于抗原肽的免疫原性比 果表明纯化后的 e IgY 活性几乎没有损失 。 较弱 ,故用抗原肽的制得的抗体效价都不是 参考文献 : 太高的 。尽管测得的滴度偏低 ,但特异性和 2 Wheaton. Effects of passive immunization of ewes against an in1 hibin - peptide on gonadotropin levels ,ovulation rate ,and pro2 生物活 性 试 验 的 结 果 可 说 明 所 制 备 的 e IgY () lificacyJ . Biol Reprod ,1995 Apr ,52 4:878 - 884 . 有较高的特异性 。研究表明用未成熟雌性小 2 夏银 ,等 1 抑制素被动免疫对大鼠排卵率及血浆雌二醇 鼠子宫的增重效果结合间接 EL ISA 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 来评 () 与孕酮的影响J 1 畜牧兽医学报 ,1999 ,30 1:6 - 101 价抗抑制素抗体的生物效价是一个较理想的 3 α沈维雄 ,等 1 人抑制素亚基片断的合成及抗体的制备 () J 1 生殖与避孕 ,1993 ,13 2:90 - 941 μ方法 ,本实 验 初 步 证 明 800l 的 纯 化 卵 黄 液 4 王进 荣 , 杨 利 国 1 如 何 纯 化 卵 黄 抗 体 J 1 生 物 技 术 , 相当于 10 单位的 FSH ,1 枚鸡蛋的卵黄体积 () 2000 1:271 为 20ml 左右 , 以鸡作 生 物 反 应 器 , 1 只 鸡 蛋 5 谢成侠 ,刘铁铮 1 家畜繁殖原理及其应用 1 第 2 版M 1 的卵黄抗体的产量相当于 250 单位的 FSH。 南京 :江苏科学技术出版社 ,1994 ,871 Preparation and determination of anti - inhibin e IgY WANG J in - rong , YANG Li - guo ,L IU Yu (Animal Reproduction Lab ,College of Animal Science and )Technology ,Nanjing Agriculture University ,Nanjing 210095 ,China ( (Abstract :Laying hens were actively immunized with synthetic human inhibin peptide fragment hIHN 1 ) ) ( ) ( ) - 26Tyr . GlyConjugated to either keyhole limpet hemocyanin KL H ,n = 8or saline alone n = 12. The ( ) aim is to attain large mount of anti - inhibin e IgY. The serum antibody sIgYresponse and the transfer of chicken serum antibody to the egg yolk were studied. All hens showed response . High purified anti - in2 hibin e IgY was made with the way of combining the p H ,nonglyprotein and glyprotain Inhibit EL ISA analy2 () sis demonstrated that the antibody isolated from egg yolk e IgYhad high specialty. Indirect EL ISA analy2 sis showed that it also had high affinity ,and ODof e IgYand purified e IgYwere equal to that of sIgY. 450 Three days continuous injection of e IgY could obviously increase uterus weigh of unmatured mice . Key words :e IgY; EL ISA ;inhibin () 文章编号 :1004 - 311X200006 - 0015 - 04 中图分类号 :Q9491329 文献标识码 :A 彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性研究 王宜磊 ,刘兴坦 ()菏泽高等师范专科学校生物系 ,山东 菏泽 274015 摘 要 :测定了彩绒革盖菌在 PDY 液体培养基中的漆酶和多酚氧化酶活性 。在 30 ?,110r/ min ,恒温振 荡培养条件下 ,漆酶第 9d 达产酶高峰 ,最高酶活 39516u ;多酚氧化酶第 14d 达产酶高峰 ,峰值 54910u ; 酶 作用的最适酸碱度为 :漆酶 p H416 ,多酚氧化酶 p H510 ; 最适作用温度漆酶为 25 ?,多酚氧化酶为 30 ?; + 2 + 2 + 2 + 2 + + 3 + K、Zn等离子对漆酶有激活作用 ,Mn、Ba、Mg等离子对多酚氧化酶有激活作用 ,Ag 、Fe对二 种酶均有抑制作用 。 关键词 :彩绒革盖菌 ;漆酶 ;多酚氧化酶 ( ) ,其降解木质素有木质素降解能力的白腐菌 彩绒革盖菌 Corilus versicolor是一种具 的能力主要取决于木质素过氧化物酶 、漆酶 、 多酚氧化酶和愈创木酚氧化酶活力的高低 , ()基金项目 :山东省科委科研基金资助项目 971164805 收稿日期 :1999 - 11 - 18 ;修回日期 :2000 - 09 - 18 所以研究其活力和分泌情况对木质素的生物 生 物技 术第 10 卷第 6 期16 5 ?、10 ?、15 ?、20 ?、25 ?、28 ?、30 ?、32 ?、降解 、生物制浆和环境保护具有十分重要的 1 22 意义 。国外已有彩绒革盖菌漆酶的报道, 35 ?、40 ?、50 ?、60 ?、70 ?的 水 浴 中 按 但主要集中在漆酶对木质素作用后所造成的 11411 法测定漆酶和多酚氧化酶的活性 。 木质素结构上的变化 ,有关漆酶和多酚氧化 表 1 漆酶 、多酚氧化酶活力测定 3 酶的活性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 报道较少; 国内有关的研究 Table 1 Determination enzyme of activities of laccase and polyphenol oxydase 4 ,5 ,6,至今未见彩绒革盖菌漆酶和报道更少 () 粗酶液ml测定波长 酶类 反应试剂 缓冲液 () ()或稀释液nm多酚氧化酶的研究报道 。本文测定了彩绒革 0. 5ml3 .36mM 3. 4ml0 .1M 盖菌在 PDY 培养基中生长时二酶活力的变 600 011 漆酶 邻联甲苯胺pH4 .6 醋酸盐 (化 ,酶作用的最适条件 p H 值 、温度 、激活剂 多酚氧 0. 5ml0 .1M 3. 4ml0 .1M 011 400 化酶 邻苯二酚pH5 .0 醋酸盐 ) 和抑制剂等,研究木质素的生物降解作用 。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 2 结果与讨论 111 材料 11111 彩绒革盖菌 :由作者自山东荷泽市枯 ()211 漆酶 、多酚氧化酶活力测定 图 1 杨树桩上分离 、纯化 、筛选而得 ,经测定发现 具有较高的漆酶和多酚氧化酶活性 。 ( ) 11112 化学试剂 :邻联甲苯胺 R. P、邻苯二 ( ) 酚 R1P为上海试剂总 厂 生 产 , 其 余 试 剂 均 为分析纯或化学纯 ,由上海试剂总厂生产 。 112 培养基 11211 PDA 固体培养基 : 马铃薯 20 % ,葡萄 糖 2 % ,琼脂 2 % 。 11212 PDY 液体培养基 : 马铃薯 20 % ,葡萄 糖 2 % ,酵母膏 1 % 。 113 培养方法 11311 接种母液制备 : 150ml 三角瓶中装液 (体培养基 30ml ,接入一定量 7 日龄斜面 或平 ) 板菌种 ,110r/ min ,30 ?,恒温振荡培养 5d 。 Corilus versicolor 的漆酶 、多酚氧化酶产酶曲线 图 1 11312 液 体 培 养 : 50ml PDY 培 养 基 装 入 “ ?—?”漆酶 “; ?—?”多酚氧化酶 1 250ml 三角瓶中 ,灭菌后接入 1ml 接种母液 , 30 ?,110r/ min ,恒温振荡培养 。 114 酶活测定方法 11411 粗 酶 液 制 备 : 将 上 述 液 体 培 养 的 试 样 ,每天取样 ,4 ,000r/ min 离心 15min ,上清液 即为粗酶液 。 7 ,8 ( 11412 漆酶和多酚氧化酶活力测定略 ) 改: 按表 1 所示加入各试剂 , 漆 酶 在 25 ?, 多 酚 氧 化 酶 在 30 ?的 恒 温 水 浴 中 保 温 30min ,在 756MC 型紫外可见分光光度计上按 () 表 1 所示波长测光密度 OD 值,以煮沸灭活 的酶液为比色对照 ,以每分钟光密度值增加 0101 定义为 1 个酶活力单位 。 11413 p H 对酶活 力 的 影 响 : 分 别 用 醋 酸 盐 或磷 酸 盐 配 制 成 p H 为 310 、316 、410 、412 、 416 、418 、510 、512 、516 、610 、710 、810 的 缓 冲 图 2 p H 对漆酶 、多酚氧化酶活力的影响 液 ,按 11411 法测定不同 p H 下的漆酶和多酚 “ ?—?”漆酶 “; ?—?”多酚氧化酶 1 氧化酶的酶活性 。 11414 温 度 对 酶 活 力 的 影 响 : 分 别 在 0 ?、 2000 年 12 月彩绒革盖菌漆酶及多酚氧化酶活性研究 17 + 2 + 2 + K、Zn等 离 子 对 漆 酶 有 激 活 作 用 , Mn、 2 + 2 + Ba、Mg等 离 子 对 多 酚 氧 化 酶 有 激 活 作 + 3 + 用 ,Ag 、Fe等离子能明显抑制二 酶 活 性 , 其它离子对二酶活性影响较小 。 有关漆酶和多酚氧化酶对木质素作用的 ( 具体方式 ,攻击的部位 ,最佳产酶条件 培养 ) 基 、碳氮源 、通气量 、接种量等都有待于进一 步研究 。 表 2 金属离子对酶活力的影响 Table 2 Effect of ion metal on laccase and polyphenol oxy2 dase 相对酶相对酶 试剂 试剂 ( )( )活力 % 活力 % ((1. 5mg 1.5 mg 多酚多酚 漆酶漆酶 ))/ ml / ml 氧化酶氧化酶 图 3 温度对漆酶 、多酚氧化酶活力的影响 MgSO〃5HO 对照100 100 74 132 4 2“ ?—?”漆酶 “; ?—?”多酚氧化酶 1 ZnCl NaCl 75 113 127 74 2 由图 1 可知 ,漆酶第 3d 能测到酶活 ,第CuSO〃7HO KCl 144 94 88 78 4 2CaCl〃2HO 2 29d 达酶活高峰 ,最高酶活为 395 . 6u ; 多酚氧 118 102 MnSO〃HO 81 199 4 2FeCl〃6HO 3 2化酶第 6d 能测到酶活 , 第 14d 达产酶高峰 , MnCl 40 0 89 190 2最高酶活为 54910u ,由此看来漆酶产生相对BaCl 2AgNO / 163 0 0 3较早 ,但第 9d 后酶活逐渐降低 ,在木质素的 Na S O74 110 2 4 降解中可能是较早发挥作作用的酶类 ,多酚 氧化酶产生较漆酶晚 ,但产酶维持时间较长 , 参考文献 : 可能是对木质素进一步降解的酶类 。 1 T. K. Kirk and H. - m. Chang. Decomposition of lignin by () 212 p H 对酶活力的影响 图 2:由图 2 可以 white - rot fungi . ?. Characterzation of heavily degraded 看出 , 漆酶作用的最适 p H 值为 416 , 和文献 lignins from decayed spruce J . Holzf orschung ,1975 ,29 : 56 4 ,6 - 64 . 所用相同或相近,多酚氧化酶最适 p H 为 7 ,8 2 T. K. Kirk and H. - m. Chang. Decomposition of lignin by 510 ,和他人用的 p H610 有所不同,是菌株 white - rot fungi . ?. Isolation of heavily degraded lignins from 之间差异 ,还是其它原因尚有待于进一步研 decayed spruce J . Holzf orschung ,1974 ,28 :217 - 222 . 究 。 3 G. F. Leatham , M. A. Stahmann. Studies on the laccase of () 213 温度对酶活力的影响 图 3:图 3 可见 , Lentinus edodes . Specificity , localization and association with 漆酶作用的最适温度为 25 ?,较文献报道所the development of fruiting bodies J . J. Gen . Microbil . 1981 ,125 :147 - 157 . ( ) 用温 度 28 ?略 低 , 但 作 者 多 次 实 验 确 实 25 ?时酶活最高 ,28 ?酶活已明显降低 ,30 ? 4 周金燕 , 等 1 真菌产生的锰过氧化物酶和漆酶的研究 () J 1 微生物学报 ,1993 ,33 5:387 - 3911 时酶活更低 ,60 ?时已接近为 0 ,说明漆酶作 5 秦小琼 ,等 1 红栓菌胞外漆酶的诱导 、纯化及部分特性 用的最适温度较窄 ,温度过高会严重抑制酶 () 研究J 1 微生物学报 ,1996 ,36 5:360 - 3661 活性 ;多 酚 氧 化 酶 作 用 的 最 适 温 度 为 30 ?, 6 方自若 ,等 1 几种担子菌胞外漆酶同功酶谱的研究 J 1 和文献所用相同或相近 ,且其对高温的适应 () 真菌学报 ,1985 ,4 3:147 - 1571 性明显强于漆酶 ; 在 0 ?的低温 下 二 酶 均 有 7 曾进鉴 1 碳源和氮源对平菇菌丝胞外酶的诱导作用 J () 1 食用菌 ,1992 , 1:17 - 181 一定的酶活力 ,这在其它酶类中较少见 。 8 潘迎捷 , 等 1 香菇菌丝生长中多酚氧化酶的动态变化 214 金属离子对酶活力的影响 : 由表 2 可以 () J 1 食用菌 ,1990 , 3:4 - 61 看出 ,当酶反应液内盐浓度为 115mg/ ml 时 , Studies on lacca se and polyphenol oxida se activites of Coril us versicolor WANG Yi - lei ,L IU Xing - tan ()Biology Department of Heze Teacher’s College , Heze 274015 ,China Abstract :The laccase and polyphenol oxidase activies of Corilus versicolor were studied when it was cul2 tured in PDY fluid medium. The peak of enzyme production appeared in the 9th day for laccase and 14th Vol . 10 ,No . 6 第 10 卷第 6 期生 物 技 术 2000 年 12 月 B IOTECHNOLOGY Dec ,2000 for polyphenol oxidase in the castant temperature vibration of 30 ? and 110r/ min ,the maxmum enzyme activity of the former was 395 . 6u and the later was 549 . 0u. The optimum temperature and p Hwere 25 ?, 2 + + Zn4 . 6 for laccase and 30 ?, 5 . 0 for polyphenol oxidase , Kand were activators for laccase and 2 + 2 + 2 + 3 + + Mn,Ba,Mgfor polyphenol oxidase ,whereas Feand Ag were inbhited for both of them. Key words : Corilus versicolor ; laccase ;polyphenol oxidase + () 中图分类号 :Q81311 1 文章编号 :1004 - 311X200006 - 0018 - 03 文献标识码 :A 水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用 梅兴国 ,张舟宁 ,苏湘鄂 ,龚伟 () 华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉 430074 ( ) ( ) 摘 要 :通过添加不同浓度的水杨酸 SA,比较了它们对红豆杉细胞过氧化物酶 POD、苯丙氨酸解氨 ( ) ( ) 酶 PAL、过氧化氢 HO含量及对细胞生长和紫杉醇含量的影响 ,结果表明 ,SA 可提高 POD 及 PAL 的 22 活性 ,促进细胞内 HO含量的上升并有利于紫杉醇的合成 ,其中 20mg/ L SA 对紫杉醇合成的促进效果 22 最明显 ,紫杉醇含量可达对照组的 13 倍 。 关键词 :紫杉醇 ;水杨酸 ( ) Taxus Chinensis 愈伤组织 ,经多次国红豆杉 植 物 在 受 到 外 界 刺 激 时 会 发 生 防 御 反 筛选继代 。由本实验室提供 ,代号为 C,培应 ,表达病原相关蛋白质并合成抗毒素 。植 42 # 物抗毒素是植物细胞次生代谢产物 ,在细胞 养基为 62 。 内的含量很低 ,甚至一般情况下不合成 ,通过 112 诱导处理 : 实验采用 250ml 三角瓶 , 每 优化培养基成分和调控培养条件往往不能有 瓶分装 100ml 液体培养基 , 接种抽滤后的鲜 效提高其产量 。于是人们根据植物自身的防 ( ) 细胞 10g ,25 ?摇床培养 120r/ min。水杨酸 御反应 ,利用生物和非生物诱导剂胁迫植物 ( ) 于悬浮培养的第 14d 0h加 入 , 添 加 的 终 浓 细胞合成并积累次生代谢物 。已知许多真菌 度分别为 5mg/ L 、10mg/ L 、20mg/ L 、50mg/ L 。 或病毒均能诱导植物产生抗性 ,另外有些小 ( 113 测定方法 : 将抽滤干的细胞按 1?1 W/ 分子化合物如乙烯 、水杨酸 、茉莉酸甲酯 、寡 ) () V加入磷酸盐缓冲液 p H710 ,10mmol/ L,冰 糖素等也可作为诱导子 。许多生物诱导子是 浴中 匀 浆 , 10 , 000r/ min , 冷 冻 离 心 10min , 取 不同化合物组成的粗提物 ,既有活性成分又 上清液作为粗酶液 。 2 有拮抗成分 ,造成实验重复性差 ,而直接利用 11311 POD 活 力 的 测 定 : 按 文 献方 法 测 信号分子进行诱导 ,则可避免这种情况 。 定 ,以光密度变化 011/ min. mg 蛋白为 1 个活 ( ) 水杨酸 salicylic acid , SA是一种广泛存 力单位 ,用 A表示 。 POD3 在于植物体内的酚类物质 ,不仅参与许多生 11312 PAL 活 力 的 测 定 : 按 文 献方 法 测 理过程 ,还与植物抗病反应密切相关 。近来 , 定 ,以光密度变化 011/ h. mg 蛋白为 1 个活力 SA 作为植物系统获得性抗性所必需的信号 单位 ,用 A表示 。 PAL 分子而受到广泛的关注 ,并被认为是一种新 11313 HO含 量 的 测 定 : 取 适 量 抽 滤 后 的 22 1 的植物激素。本文考察了水杨酸对红豆杉 () 细胞 300mg - 400mg加 预 冷 的 丙 酮 1ml , 冰 ( ) 细胞过氧化物酶 POD活力 、苯丙氨酸解氨 浴中 匀 浆 , 10 , 000r/ min , 冷 冻 离 心 10min , 取 4 ( ) ( ) 酶 PAL活力 、过氧化氢 HO含量 、细胞活 22 上清液按文献方法测定 ,以 01001 光密度/ () 力和紫杉醇 taxol含量的影响 。 mg 细胞为 1 个单位 ,以 A表示 。 H O 2 2 511314 蛋白质含量的测定 : 用 Bradford 法 1 材料与方法 测蛋白质含量 ,以牛血清白蛋白作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 11315 红豆杉细胞活力的测定 : 取 100mg 抽 111 实验材料 :试验用红豆杉细胞株来自中 ( 滤 后 的 细 胞 , 加 215ml 的 磷 酸 盐 p H710 , ) 011mol/ L缓冲液和 215ml 0 . 4 %TTC ,25 ?暗 收稿日期 :2000 - 01 - 10 处 反 应 13h , 用 蒸 馏 水 洗 涤 3 次 后 , 加