蛋白质浓度测定
實驗 4 蛋白質濃度測定 Folin-Phenol (Lowry)測定法
目的要求
(1)學習Folin-phenol法測定蛋白質含量的原理及
方法
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。
(2)製備標準曲線,測定未知樣品中蛋白質含量。
原理
目前蛋白質含量測定有兩類方法,一類是利用蛋白質的物理化學性質, 如折射率、比重、紫外吸收等測定得知;另一類是利用化學方法測定蛋白質 含量,如微量凱氏定氮、雙縮脈反應、Folin-phenol試劑法(又名Lowry method)。Folin-phenol法的優點是操作簡單,迅速,不需特殊儀器設備,靈敏度高,較紫外吸收法靈敏10-20倍,較雙縮脲法(Biuret method)靈敏100倍,反應約在15min內有最大顯色,並至少可穩定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素千擾。在測試時應排除千擾因素或做空白試驗消除。
Folin-phenol試劑可由A試劑與B試劑組成。A試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、
硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質中的肢鍵在鹼性條件下,與酒石酸鉀鈉銅鹽 溶液起作用,生成紫紅色絡合物。B試劑是由磷鋁酸和磷鎢酸、硫酸、溴等 組成。此試劑在鹼性條件下,易被蛋白質中酪胺酸的酚基還原呈藍色反應, 其色澤深淺與蛋白質含量成正比。此法也適用於測定酪胺酸與色胺酸含量。
本法可測定範圍是25-250 μg蛋白質。
試劑和器材
一、試劑
1,標準蛋白質溶液
結晶牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)配製成標準液150 μg/ml 蛋白質溶液。
2,Folin-phenol試劑
二、測試樣品
三、器材
試管及試管架,0,5,1及5m1吸量管,恆溫水浴,分光光度計。 操作方法
一、製作Folin-phenol法標準曲線
取7支試管,依下
表
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操作。
繪製標準曲線:以A值為縱坐標,標準蛋白質含量為橫坐標,在坐標紙上650
繪製標準曲線。
1 2 3 4 5 6 7
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 標準蛋白質溶液/ml
1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒸餾水/ml
Folin-phenol試劑/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混勻,於20-25 C放置10 min,以蒸餾水為空白,在650 nm處比色 A 650
本實驗選用波長650 nm。請用Microsoft Excel 程式做圖及計算標準曲線如下圖(例):
二、測定未知樣品蛋白質濃度測定
空白管2 樣品管2
0 0.2 未知濃度BSA溶液/ml
1.0 0.8 蒸餾水/ml
5.0 5.0 Folin-phenol試劑/ml
混勻,於20-25 C放置10 min,在650 nm處比色
A 650
問題:
1. 分光光度計測量蛋白質原理為何
2. Folin-phenol測定蛋白質的原理是什麼?
3. 請比較其他蛋白質定量法之優缺點。
4. 干擾本實驗之因素有哪些?
參考文獻
, Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A.L. Farr and R. J. Randall, 1951. Protein
measurement with the Folin-Phenol reagents. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
, Dunn, M. J., 1992. Protein determination of total protein concentration. Harris,
E. L. V., Angal, S., [Eds], Protein Purification Methods, Oxford: IRL Press.
, Price, N. C., 1996. Proteins, Labfax, Oxford: Academic Press.
浙公网安备 33021202002483