【doc】以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD

【doc】以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD 以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离 纯化猪血SOD .;一)Lf,7 第l2卷第3期 1996~6月 生物化学杂志 Chi. neseBiochemicalJournal 仁 Vo1.12.No.3 Jun.,1996 以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD' 周立郑远旗 t四川大学生糟南 李建吾蒋磊 成都6D)0643l…610~)41(中国科学晓或都生物所,或) 摘要以魔芋葡甘聚糖(KGM)凝胶作为铜金属螫合亲和层析的载体一步亲和纯化猪 ,了7 血SOD,得到电泳均一.比活为8622U/rag,纯化倍数为77.8倍的SOD,其回收率为 85.4 关键擢,, 琼脂糖凝胶(Sepharose)和葡聚糖凝胶(Sephadex)是两种优良的分离纯化大分子蛋白质的 亲和载体.在长期的科学研究中已得到证实,但因价格昂贵给一些研究工作造成困难,因此开 发新的价格低廉,效果良好的分离介质是非常必要的,而魔芋葡甘聚糖 (KonjacGlucomannan, 简称KGM)凝胶具有成为这类载体的可能. KGM凝胶是来源于在我国分布广泛,品种繁多的天南星科植物魔芋的一类复合多糖,是 葡萄糖与甘露糖以1,4一糖苷键连结而成的分子量为10的大分子糖类,在一定条件下交联形 成的网状结构,多孔网状的KGM凝胶具有机械强度高,化学惰性,理化性质稳定,流速好等亲 和载体的基本属性u'. 超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,简称SOD)是生物体内的具有歧化超氧化物阴离 子自由基成为o和HO:的一类金属蛋白酶,对机体具有保护,抗炎,止血和防止细胞老化等 功能,我们已用SephadexG一200作载体亲和纯化出高纯度,高比活SOD].本文报道用KGM 凝胶作为亲和载体分离纯化SOD,与SephadexG一200作载体分离SOD作比较,探讨KGM凝 胶作为亲和载体的可能性. 1材料和方法 11材料 KGM凝胶(中科院成都生物所提供),硼氢化钠(Merck产),丙烯酰胺和考马斯亮蓝R一 250(Fluka产),其余试剂均为国产分析纯. 1.2KGM凝胶特性检测 KGM凝胶稳定性,膨胀度及机械强度[:取KGM凝胶加等体积的含0.5硼氢化钠的2 mol/L氢氧化钠溶液,在沸水浴中加热4h,观测其稳定性;取KGM凝胶25ml,乙醇脱水烘干, 祢重,以m1湿胶每g干胶值为膨胀度,即柱床体积;将KGM凝胶装1×40cm柱, 在恒压作用 ?国家自然科学基金资助项目 收稿日期:19999321.修匠日期:199506g9 344 下,用蒸馏水洗柱,观测在连续运转过程中流出液的流速,以评价KGM凝胶的机械强度,即流 速的稳定程度. KGM凝胶排阻分子量范围:将蓝色葡聚糖2000分别与胰蛋白酶,牛血清白蛋白和铁蛋白 等量混合,用pH7.o的0.05mol/L磷酸缓冲液溶解使每种物质为10mg/ml,取0.25,0.3ml 上1×40cm的KGM凝胶柱,以同种缓冲液在10.2滴每分每厘米的泵压下进行洗脱以检测 KGM凝胶的排阻限度,确定应用范围. 1.3SOD的分离纯化 屠宰猪血经抗凝离心得红细胞,血红蛋白按Yasuda方法除去,Cu一金属螯合柱以KGM 凝胶为基质,按Hemdan和Porath方法制备,SOD活性测定用邻苯三酚自氧化法.,蛋白质 测定按Lowry法,PAGE按莽克强等:的方法,SOD紫外光谱测定在岛津uV一240记录式紫外 分光光度计上进行. 2结果 2.1KGM亲和层析凝胶载体性能 稳定性,膨胀体积及流速:以下凝胶的湿态粒径均为l1O,220um,按前述方法对不含和 含琼脂糖的KGM凝胶进行稳定性实验,均未见软化和溶解变形现象,表明KGM凝胶抗碱耐 温性能好.膨胀度和机械强度实验结果如Table1, Table1Bedvolumesandflowrateso/theKGMgelcarriers 由Table1可见各种不同的KGM凝胶都有一定的膨胀度,即一定的柱床体积,随琼脂糖 量的增加而增加,其变化范围为14,41,1ml湿胶每克干胶,相当于SephadexG--7550G一200的 床体积;各种不同的KGM凝胶都有一定的机械强度,但随琼脂糖量的增加而变小. Table1所述的未含琼脂糖的KGM凝胶能将蓝色葡聚糖(>10)与胰蛋白酶(为2.4 ×10)完全分开,表明后者进入了多孔的KGM凝胶孔穴;用KGM/Agarose=2.5:1.O 的凝胶 能完全分离蓝色葡聚糖与牛血清白蛋白(BSAM为6.7×104),显示BSA进入了多孔的KGM 凝胶,此凝胶同样能完全分离蓝色葡聚糖与铁蛋白(M为4.8×10)的混合物,表明铁蛋白也 进入了此凝胶的网孔,由此可推断对于高于KGM/Agarose一2.5:1.0中琼脂糖浓度的KGM 凝胶,铁蛋白或比铁蛋白还要大的蛋白分子可进入多孔的KGM凝胶孔穴. 根据文献[8],SephadexG一200X~球蛋白的工作范围为分子量5×10,5×10,而铁蛋白的 分子量为4.8×10可进入含琼脂糖大于28.6的KGM凝胶,说明本法制备的多孔性KGM凝 胶的排阻限度?SephadexG一200的排阻界限,可用于分子量小于10的生物高分子物质的分离 345 纯化. 2.2用KGM/Agarose=2.0:1.0的KGM凝胶分离SOD 去除血红蛋白的SOD粗酶液,用0.2mol/L Na2HPO}调pH至8.3,上用pH8.3的0.05mol/L PB,0.2mol/LNaC1平衡的Cu—KGM亲和层析 柱(1.2×8cm)分离纯化SOD,用平衡液洗去杂 蛋白后.用pH6.0的0.05mol/LPB,0.5mol/L NaC1洗脱SOD,3.5ml/管收集,流速为 16ml/h.洗脱曲线见Fig.1,由Fig.1可见洗下单 一 的具SOD活力的蛋白峰. 上柱SOD总活力为82392U,KGM亲和层 析后可得总活力70359U,活力回收为85.4, SOD比活为8622U/mg,纯化结果见Table2. Fig.1CopperchelateMfinitychro~tographyof porcineSODonKGMgelcolumn Theflowratentednedttt16ml/h.Colu田n:12 ×8till ?—?A2?C—CSODactivity Table2ThepurificationofporcineredcellsSOD 所得SOD经PAGE为一条带(上样量60g,Fig.2),其紫外吸收光谱为特征图谱 (Fig.3). 垂rig.2Thepictureelectrophoresisofporcine redcellsSODinpolyacrylamldegel 用本文报道的KGM凝胶作为亲和载体纯化SOD,在亲和柱的SOD饱和吸附量,回收率,纯化 倍数方面与SephadexG一200作载体金属螫台亲和层析SOD比较结果见Table3. 346 F.3TheuVsp~trumofSOD Table3SODpurificationcomparisonintwosubstrate 3讨论 用KGM凝胶为载体,金属螯合亲和层析分离纯化猪血SOD,得到电泳均一,比活高达 8622U/mg,纯化倍数为77.8的SOD,由此可见KGM凝胶为载体亲和纯化SOD是可行的. 由TabM3可见,KGM凝胶作为Cu一金属螫合亲和层析的载体与SephadexG-200作为载 体分离纯化SOD比较每毫克湿凝胶对SOD的吸附单位相近,SOD的活力回收稍低于 SephadexG200,且对SOD的纯化倍数高于SephadexG一200,这样看来KGM凝胶作为载体纯 化SOD基本能达到或近似SephadexG一200的效果,所以从金属螯合亲和纯化SOD的角度, KGM凝腔是可以替代SephadexG一200的.不同KGM/Agarose比例的KGM凝胶与Sepharose 4B性能比较分离sOD及其它生物大分子工作正在进行(另文发表).由于KGM凝胶的价格 大大低于Sephadex@200,所以在生物大分子的研究中,KGM凝皎是一种具有发展前途的载 体. 从实验中发现,KGM凝胶的抗碱性比SephadexG一200稍差,在其制备过程中需加以改 进. 参考文献 1贾成禹,等.生物化学杂志,1988.4;4O7—413 2周立,等生物化学杂志,1989,5;265—269 3贾成禹,等生物化学杂志,1991,3:359--364 4YasudaFrDernaMe.FR}1980.2:485,203 5HemdanES,Por毗hJ.JC一,,1985,323:247 6邹国林,等.生物化学与生物物理进展,1986.(4)一71 7莽克强,等.聚丙烯酰胺凝腔电诛.北京:科学出版社,1975 8林卓坤主编,色谱法(--),第一版.北京:科学出版杜,1982:67 PurificationofPorcineSoDhyMetalChelateAffinity ChromatographyUsingKGMGelasSnbstrate ZhouLiZhengYuan—QiLiJian—WuJiangLei (BiologyDeparlmenlofSichuanVnlvers~ty,Chengdu610064) JiaCheng—Yu (ChengduInstituteofBiology,AcodemiaSinica,Chengdu610041) AbstractKGMgelwasusedassubstrateforchromatography,epichlorohydrinasactivitorand iminodiaceticacidasligands,thenCuwaschelatedtoformCu—metalchelateanntychro— matographiccolumn.TheSODinprocineredcellswaspurifiedtohomogeneousinonestepaffini— tychromatography.Itsspecficactivityis8622U/mg,yieldis85.4andthepurificationfactoris 77.8.ItwasdiscussedthatitispossiblethatSephadexG一 200couldbesubstitutedbyKGMgelin biologicalmacromoleculeinvestigation. Keywords{KGMge1.Superoxidedismutase,Metalchelateaffinitychromatograph 347