HepG2细胞的培养条件_(1)

HepG2细胞的培养条件_(1)HepG2细胞培养的相关条件HepG2人肝肿瘤细胞株广泛应用于遗传毒理学及病毒培养等方面的研究,研究肝脏疾病发病机理及其临床应用有着重要意义。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。本文对肝癌细胞培养的最佳条件做一简单综述。1(HepG2细胞的复苏条件1.1复苏温度的选择[1]唐孟萱等采用下述方法进行细胞复苏:快速将所冻存细胞40?水浴摇床60转/min慢摇至其溶解，溶解后马上转入37?水浴箱，手工慢摇恒温2,3min复苏,复苏后800转/min离心5min,吸去上清加入10ml含15%胎牛血清DMEM培养基,混匀后加入细胞培养板,每孔1ml，5%CO温箱37?培养。唐孟萱等将上述方法2[2]与细胞专著所述方法相比较，传统37?水浴方法复苏后细胞存活率为68.4%，先40?溶解后37?恒温方法复苏后细胞存活率为85.7%。证明其所用方法优于传统方法。1.2复苏用培养基的选择[3]钟志宏等使用培养基培养基RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养，结果发现，用DMEM培养基培养的细胞结4果在接种密度为1×10/cm、血清含量为15%时，经6h培养后细胞2开始贴壁，12h后大部分细胞贴壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例传代。而用RPMI-1640培养基培养的细胞在接种密度为14×10/cm、血清含量为20%时，时，经6h培养后细胞贴壁不明显，2但12h后部分细胞贴壁，24h后亦大部分细胞贴壁，且增值速度相对较慢，5天后可以按1:3的比例进行传代。以上结果说明，使用DMEM培养基既可以节省血清，细胞贴壁所用时间短、增殖速度快，并且传代细胞培养也使用DMEM培养基，使用DMEM培养基进行复苏，避免了配制不同培养基所带来的麻烦，因此在HepG2细胞复苏中推荐使用DMEM培养基。1.3复苏时的接种密度[4]42甘起霓等研究发现当接种密度为1×10/cm，血清含量为20%时,细胞24后大部分贴壁,且增殖速度最快,5d后可按1:3比例传42代;当接种密度大于1×10/cm和(或)血清含量少于20%时,细胞42表现为贴壁困难,出现进行性退化;当接种密度小于1×10/cm血清含量为20%时,细胞24h后大部分贴壁,但增殖速度明显减慢,约7d后才可按1:3比例传代。2(消化酶及消化时间的选择[1]唐孟萱等研究发现，EDTA+胰酶的消化能力太强，消化时间不好把握，传代消化后细胞死亡较多;EDTA消化能力太弱，消化时间太长且不易将细胞消化完全;用PBS将细胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆盖细胞约30s后吸去胰酶，37?放置2,3min，显微镜下可[3]观察到细胞消化适度。钟志宏等将待传代细胞不用PBS洗涤和用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后分别用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA.Na溶液进行消化(消化液用量为盖满瓶底)，观察时间为30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟。结果发现:不用PBS洗涤的细胞分别用上述两种酶消化，10分钟后细胞仍然消化不完全。用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后的细胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化时，分别经3分钟、1分钟和0.5分钟能完全消化好细胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA.Na溶液进行消化时，完全消化好细胞约需3分钟、1.5分钟、1分钟。二者的结果相符。根据上述结果可知，在进行HepG2细胞的消化时，先用pH7.2的PBS洗涤三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液[5]消化0.5分钟效果比较好。费洪新等人则推荐使用如下方法进行消化:果明显，对细胞的影响小。一般适宜的消化方法是:用1×PBS将细胞洗涤2次再加入适量的0.15%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA并以7:3的体积比混合)覆盖细胞约20秒后吸去胰蛋白酶(含有0.02%EDTA并以7:3的体积比混合)。3(培养基中血清浓度的选择由于人肝癌细胞株生长缓慢，恶性程度较高，对于血清的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 比较严格，其培养时所需要胎牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一[5]些。些经验，费洪新等人认为在含15%胎牛血清的DMEM培养基[3][6]中HepG2人肝癌细胞生长迅速。钟志宏、王爽等人的实验结果也[4]支持上述结果。甘起霓则认为血清含量为20%时,HepG2细胞贴壁后增殖速度最快。当HepG2细胞增殖数代后,待其状态稳定时,可将[1]血清含量逐渐降至10%。唐孟萱等人则认为12%的血清浓度足以满足HepG2细胞的生长。4(双抗浓度的选择[6]王爽等通过正交实验优选发现，双抗浓度为0.5%时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长。6(培养基pH条件的选择[3]钟志宏等人实验发现复苏细胞和传代细胞在pH6.8-7.4、5%CO2条件下培养，其贴壁和增值速度无明显变化。而无CO条件下培养时，2复苏细胞在不同pH值条件下均表现为培养液逐渐变碱性，细胞不能贴壁，且逐渐缩小，退化;传代细胞在不同pH值条件下培养，其培养液逐渐变酸性,当pH值，7.0时，经24h培养后，细胞基本贴壁，但增值缓慢，经48h培养后大部分细胞已伸出伪足，细胞数量明显增多;当pH值，7.0时，细胞贴壁困难，经72h培养后，细胞缩小、[6]呈退化趋势。王爽等通过正交实验优选发现，pH7.2时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长，与上述结果相符。7(细胞传代条件的选择[6]王爽等通过正交实验对HepG2细胞的传代条件进行优选，他推[1]荐在细胞汇合度达95%-1000%时进行传代。唐孟萱等人的研究结果表明HepG2细胞生长至汇合度50%,95%时是对数生长期,死细胞相对较少;而当汇合度达到100%时,生长趋于平台期,死细胞数开始增加;特别是汇合度100%以后再继续培养,死细胞数明显增加而活细胞数减少。据此可确定HepG2细胞培养最佳的传代时期是在汇合度95%,100%之间。二者的实验结果相符，推荐在汇合度在95%-100%时进行细胞传代。<参考文献略>PET/CT示踪剂18F-FDG(氟代脱氧葡萄糖)氟代脱氧葡萄糖氟代脱氧葡萄糖是2-脱氧葡萄糖的氟代衍生物。其完整的化学名称为2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖，通常简称为18F-FDG或FDG。FDG最常用于正电子发射断层扫描(PET)类的医学成像设备:FDG分子之中的氟选用的是属于正电子发射型放射性同位素的氟-18(fluorine-18，F-18，18F，18氟)，从而成为18F-FDG(氟-[18F]脱氧葡糖)。在向病人(患者，病患)体内注射FDG之后，PET扫描仪可以构建出反映FDG体内分布情况的图像。接着，核医学医师或放射医师对这些图像加以评估，从而作出关于各种医学健康状况的诊断。历史二十世纪70年代，美国布鲁克海文国家实验室(BrookhavenNationalLaboratory)的TatsuoIdo首先完成了18F-FDG的合成。1976年8月，宾夕法尼亚大学的AbassAlavi首次将这种化合物施用于两名正常的人类志愿者。其采用普通核素扫描仪(非PET扫描仪)所获得的脑部图像，表明了FDG在脑部的浓聚(参见下文所示的历史参考文献)。作用机理与代谢命运作为一种葡萄糖类似物，FDG将为葡萄糖高利用率细胞(high-glucose-usingcells)所摄取，如脑、肾脏以及癌细胞。在此类细胞内，磷酸化过程将会阻止葡萄糖以原有的完整形式从细胞之中释放出来。葡萄糖之中的2位氧乃是后续糖酵解所必需的;因而，FDG与2-脱氧-D-葡萄糖相同，在细胞内无法继续代谢;这样，在放射性衰变之前，所形成的FDG-6-磷酸将不会发生糖酵解。结果，18F-FDG的分布情况就会很好地反映体内细胞对葡萄糖的摄取和磷酸化的分布情况。在FDG发生衰变之前，FDG的代谢分解或利用会因为其分子之中2'位上的氟而受到抑制。不过，FDG发生放射性衰变之后，其中的氟将转变为18O;而且，在从环境当中获取一个H+之后，FDG的衰变产物就变成了葡萄糖-6-磷酸，而其2'位上的标记则变为无害的非放射性“重氧”(heavyoxygen，oxygen-18);这样，该衰变产物通常就可以按照普通葡萄糖的方式进行代谢。临床应用在PET成像方面，18F-FDG可用于评估心脏、肺脏以及脑部的葡萄糖代谢状况。同时，18F-FDG还在肿瘤学方面用于肿瘤成像。在被细胞摄取之后，18F-FDG将由己糖激酶(在快速生长型恶性肿瘤之中，线粒体型己糖激酶显著升高)),加以磷酸化，并为代谢活跃的组织所滞留，如大多数类型的恶性肿瘤。因此，FDG-PET可用于癌症的诊断、分期(staging)和治疗监测(treatmentmonitoring)，尤其是对于霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease，淋巴肉芽肿病，何杰金病)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma，非何杰金氏淋巴瘤)、结直肠癌(colorectalcancer)、乳腺癌、黑色素瘤以及肺癌。另外，FDG-PET还已经用于阿耳茨海默氏病(Alzheimer'sdisease，早老性痴呆)的诊断。在旨在查找肿瘤或转移性疾病(metastaticdisease)的体部扫描应用当中，通常是将一剂FDG溶液(通常为5至10毫居里，或者说200至400兆贝克勒尔)迅速注射到正在向病人静脉之中滴注生理盐水的管路当中。此前，病人已经持续禁食至少6小时，且血糖水平适当较低(对于某些糖尿病病人来说，这是个问题;当血糖水平高于180mg/dL=10mmol/L时，PET扫描中心通常不会为病人施用该放射性药物;对于此类病人，必须重新安排PET检查)。在给予FDG之后，病人必须等候大约1个小时，以便FDG在体内充分分布，为那些利用葡萄糖的器官和组织所摄取;在此期间，病人必须尽可能减少身体活动，以便尽量减少肌肉对于这种放射性葡萄糖的摄取(当我们所感兴趣的器官位于身体内部之时，这种摄取会造成不必要的伪影(artifacts，人工假象))。接着，就会将病人置于PET扫描仪当中，进行一系列的扫描(一次或多次);这些扫描可能要花费20分钟直至1个小时的时间(每次PET检查，往往只会对大约体长的四分之一进行成像)。生产与配送手段医用回旋加速器(medicalcyclotron)之中用于产生18F的高能粒子轰击条件(bombardmentconditions)会破坏像脱氧葡萄糖(deoxyglucose，脱氧葡糖)或葡萄糖之类的有机物分子，因此必须首先在回旋加速器之中制备出氟化物形式的放射性18F。这可以通过采用氘核(deuterons，重氢核)轰击氖-20来完成;但在通常情况下，18F的制备是这样完成的:采用质子轰击富18O水(18O-enrichedwater，重氧水)，导致18O之中发生(p,n)核反应(中子脱出，或者说散裂(spallation))，从而产生出具有放射性核素标记的氢氟酸(hydrofluoricacid，HF)形式的18F。接着，将这种不断快速衰变的18F-(18-氟化物，18-fluoride)收集起来，并立即在“热室(hotcell)(放射性同位素化学制备室)”之中，借助于一系列自动的化学反应(亲核取代反应或亲电取代反应)，将其连接到脱氧葡萄糖之上。之后，采取尽可能最快的方式，将经过放射性核素标记的FDG化合物(18F的衰变限定其半衰期仅为109.8分钟)迅速运送到使用地点。为了将PET扫描检查项目的地区覆盖范围拓展到那些距离生产这种放射性同位素标记化合物的回旋加速器数百公里之遥的医学分子影像中心，其中可能还会使用飞机空运服务。最近，用于制备FDG，备有自屏蔽(integralshielding，一体化屏蔽，一体化防护)以及便携式化学工作站(portablechemistrystations)的现场式回旋加速器(on-sitecyclotrons)，已经伴随PET扫描仪落户到了偏远医院。这种技术在未来具有一定的前景，有望避免因为要将FDG从生产地点运送到使用地点而造成的忙乱。