1 - 华中农业大学

硕士学位论文 课题研究内容及进展汇报 课题名称 高活性谷氨酸脱羧酶的筛选及固定化研究 研究生姓名 姚 森 年级 2005 专业 食品科学 研究方向 食品品质控制 指导教师 熊善柏 职称 教授 指导小组 熊善柏 杨特武 赵思明         食品大分子结构与功能研究室 华中农业大学食品科学技术学院 2006年11月制订 课题研究内容 1. 高活性谷氨酸脱羧酶的筛选 √ 1.1 不同品种糙米发芽后GABA的含量测定 1.2 糙米发芽前后谷氨酸及GABA含量的测定 1.3 糙米发芽后谷氨酸脱羧酶活性的测定 1.4 发芽糙米中GABA含量与GAD及谷氨酸含量的相关性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2. 谷氨酸脱羧酶的提取及同功酶鉴定 2.1 发芽糙米谷氨酸脱羧酶的提取 2.2 不同品种类型发芽糙米谷氨酸脱羧酶同功酶的鉴定 3. 谷氨酸脱羧酶的固定化及性质研究 3.1 谷氨酸脱羧酶的固定化载体及方法的选择 3.1.1 固定化介质的选择 3.1.2 固定化方法的选择 3.2 谷氨酸脱羧酶的固定化条件的选择 3.2.1 固定化的酶用量、时间、温度、pH及离子强度的选择 3.2.2 固定化条件的正交试验 3.3 固定化谷氨酸脱羧酶酶学性质研究 3.3.1 固定化GAD的最适反应温度、最适反应pH及热稳定性 3.3.2 固定化GAD的稳定性、酶失活动力学及GABA生成动力学 4. 固定化酶的应用 将制作的固定化酶制成固定化酶反应柱，用于GABA的生产，测定柱转化谷氨酸的效率及柱的半衰期。 √ 表示已完成内容(每完成一项内容就打√)   课题研究内容调整及其原因 1补充：（确定底物Glu对GABA含量生成的影响） 1.5 低中高三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力及游离谷氨酸含量的变化 分别测定稻米发芽0h、8h、16h、24h、32h、40h、48 h后GABA、GAD及游离谷氨酸脱羧酶的变化。 导 师 意 见 导师签字 年 月 日     研究内容及结果 工作时间 2006年9月1日至2007年3月19日 研究内容及结果 1.1 不同品种糙米发芽后GABA的含量测定 内容：测定188份单株水稻糙米（包括早粳稻、早籼稻、中粳稻、中籼稻和晚粳稻等品种类型，含常规籼稻、常规粳稻、恢复系籼稻、恢复系粳稻、籼糯稻、杂交稻和一些特种稻）在30℃浸泡6h，30℃发芽24h后GABA的含量。 1.1.1 不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量 不同品种(系)水稻品种发芽糙米中GABA的含量见表1。糙米发芽后GABA的含量平均值为56.84mg/100g，其变异系数为21.31％。GABA生成量在65 mg/100g以上的品系有46个，其中有10个品种(系)GABA的含量在78.72mg/100g以上，生成量最大的品种58号达87.88mg/100g，生成量最小的品种148号仅有34.62mg/100g，不同品种之间GABA的生成量大小相差近3倍。在测定的特种稻中，红黄色米的GABA含量较低，黑褐色米和糯米的含量则相对其他类型的GABA含量高。 表1 不同水稻品种发芽糙米中GABA的含量(FW) 编号 GABA含量 (mg/100g) 编号 GABA含量 (mg/100g) 编号 GABA含量 (mg/100g) 编号 GABA含量 (mg/100g) 编号 GABA含量 (mg/100g) 1 73.46 39 67.44 77 59.51 115 36.87 153 60.67 2 59.44 40 77.35 78 56.98 116 42.21 154 42.00 3 46.24 41 67.51 79 68.67 117 51.23 155 54.82 4 40.29 42 80.57 80 69.70 118 37.63 156 55.40 5 52.33 43 42.21 81 66.76 119 48.84 157 51.34 6 37.80 44 47.75 82 64.67 120 52.87 158 34.96 7 55.82 45 51.03 83 57.80 121 54.11 159 58.35 8 37.63 46 67.03 84 57.52 122 85.22 160 64.43 9 60.57 47 54.31 85 75.37 123 82.62 161 66.41 10 53.70 48 69.01 86 51.54 124 78.72 162 47.88 11 58.62 49 64.36 87 77.35○ 125 46.11 163 65.59 12 55.85 50 61.08 88 78.98○ 126 55.54 164 50.69 13 62.58 51 77.97 89 78.93○ 127 72.70 165 67.75 14 76.81 52 58.21 90 43.78△ 128 51.30 166 63.34 15 61.35 53 76.40 91 61.90○ 129 50.21 167 74.62 16 58.62 54 66.76 92 39.40△ 130 36.46 168 51.85 17 40.63 55 61.97 93 63.13○□ 131 57.47 169 87.61 18 53.29 56 72.50 94 78.03○□ 132 67.95 170 63.27 19 44.67 57 57.39 95 73.36○□ 133 65.53 171 51.37 20 39.81 58 87.88 96 54.72○□ 134 67.64 172 55.85 21 66.52 59 59.23 97 53.15○□ 135 56.02 173 62.86 22 63.41 60 68.12 98 45.35○□ 136 46.86 174 35.95 23 58.89 61 81.66 99 40.84 137 38.86 175 45.90 24 52.46 62 60.26 100 50.34 138 49.18 176 48.57 25 51.95 63 67.03 101 49.80 139 42.48 177 45.69 26 56.77 64 51.92 102 54.52 140 40.05 178 38.65 27 46.93 65 52.74 103 64.98 141 63.23 179 49.93 28 61.01 66 56.09 104 42.62 142 77.08 180 48.02 29 59.37 67 59.10 105 57.59 143 62.00 181 35.92 30 38.86 68 53.39 106 36.60 144 45.69 182 48.36 31 45.22 69 51.64 107 35.13 145 53.08 183 55.75 32 68.77 70 60.46 108 45.69 146 56.23 184 45.08 33 57.18 71 71.34 109 54.11 147 37.49 185 44.81 34 54.79 72 55.06 110 57.05 148 34.62 186 54.24 35 60.19 73 74.41 111 46.72 149 55.95 187 46.21 36 54.45 74 65.05 112 47.13 150 45.28 188 74.28 37 58.76 75 59.10 113 55.20 151 58.35     38 79.27 76 59.71 114 37.97 152 56.43                         ○为黑褐色米；△为红黄色米；□为糯米。 1.1.2 不同类型发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的差异 对所选样品中的181个品种（系）进行分类，其中含粳稻糙米品种90个，发芽后GABA的生成量为55.65±11.52 mg/100，籼稻糙米品种共91个，发芽后GABA的生成量为56.73±12.04 mg/100g。籼稻糙米比粳稻糙米发芽后GABA的平均含量高，但它们的差异不显著（T/α =-0.613/0.5407）。在选取的181份稻米品种可分为早粳稻、早籼稻、中粳稻、中籼稻和晚粳稻5大类型。不同类型品种的稻米发芽后GABA的平均生成量及其差异显著性见表2。由表2可知，各个品种类型的糙米发芽生成GABA的含量有极显著的差异（F/α = 8.23/0.0001）。不同类型的糙米发芽后GABA的生成量早稻>中稻>晚稻，其中早籼稻的平均含量高于早粳稻。 表2 不同品种类型水稻米发芽糙米中GABA含量 品种类型 品种数 GABA的含量（mg/100gFW） 显著水平（0.05） 早籼稻 18 64.50±11.53 A 早粳稻 44 60.62±9.64 A 中籼稻 73 54.81±11.44 B 中粳稻 25 53.60±12.74 B 晚粳稻 21 47.70±8.39 C         同列英文字母不同表示差异显著。 1.2 糙米发芽后谷氨酸脱羧酶活性的测定 内容：对上述188分样品中选取GABA生成量较高的10个品系：38、40、51、53、55、58、61、70、71和73号于第二年扩繁，测定糙米与发芽糙米中GABA的含量及其发芽糙米中GAD的酶活力。将发芽糙米匀浆后加入至含0.2 mM PLP、10 mM 谷氨酸的50 mM（pH 5.8）的PBS中，于37℃水浴保温1 h，测定米浆转化谷氨酸的效率。 能产生高GABA含量的稻米扩繁后的10个品种，其中糙米中GABA的含量、发芽后GABA的含量和GAD的酶活力以及发芽糙米浆转化谷氨酸的效率见表3。由表3可知，高产GABA的品种经重作扩大繁殖后，其GABA的产量仍很高，均在80 mg/100g以上，其中38、58及73号品种发芽后GABA的含量接近90 mg/100g。发芽糙米浆可以直接将添加的谷氨酸转化为GABA，其中40、53和58号品种的转化效率较其它品种高，其GAD酶活力也相对较高。 表3 发芽糙米中GAD的酶活力及对谷氨酸的转化效率 品种编号 04年测定发芽糙米GABA含量 （mg/100g） 糙米中GABA含量 （mg/100g） 05年测定发芽糙米GABA含量 （mg/100g） 发芽后GABA的增量 （mg/100g） 发芽糙米中GAD酶活力 （U/100g） 发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率 （μmolGABA/（gFW·h）） 38 79.27 15.90 89.81 73.91 0.58 2.80 40 77.35 13.88 84.59 70.71 0.68 3.67 51 77.97 12.76 85.01 72.26 0.53 3.31 53 76.40 15.21 85.17 69.96 0.70 3.57 55 61.97 19.47 81.60 62.13 0.42 2.62 58 87.88 18.57 89.71 71.14 0.65 3.65 61 81.66 24.99 83.09 58.10 0.28 1.45 70 60.46 28.67 81.49 52.82 0.45 2.69 71 71.34 23.42 83.20 59.78 0.43 2.62 73 74.41 26.57 90.03 63.46 0.49 2.40               1.3 发芽糙米中GABA增量与GAD酶活力相关性分析 内容：分析GABA的生成与GAD酶活力的相关性。 10个品种的发芽糙米中04年测定的GABA的含量（gaba04）、05年测定的GABA含量（gaba05）、发芽后GABA的增量（gabadelt）、发芽糙米GAD酶活力（gad）、发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率（eot）间的相关性分析见表4。由表4可知，04年测定的10个品种发芽糙米中GABA含量与05年测定结果有显著的相关性，表明关于GABA生成的形状是可以稳定遗传的。 表4 10个品种的发芽糙米中04年测定的GABA的含量（gaba04）、05年测定的GABA含量（gaba05）、发芽后GABA的增量（gabadelt）、发芽糙米GAD酶活力（gad）、发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率（eot）间的相关性分析表（R/α） R/α gaba04 gaba05 gabadelt gad eot gaba04 1 0.6605/0.0376** 0.6426/0.0451** 0.3612/0.3045 0.2192/0.5430 gaba05   1 0.6346/0.0487** 0.4787/0.1616 0.2584/0.4711 gabadelt     1 0.7605/0.0107** 0.6752/0.0322** gad       1 0.9254/0.0001*** eot         1             **表示显著；***表示极显著 糙米中的GABA的含量在12～30 mg/100g间，糙米经发芽后GABA的含量增长了2～5倍。GABA的增量与GAD的酶活力和对谷氨酸的转化效率有显著的正相关性，表明糙米发芽后GABA的增量差异可能是由GAD的酶活力差异而引起的。酶是基因表达的产物，因此可以通过遗传改良可获得高GABA产量的品种。发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率与提取上清中谷氨酸脱羧酶的酶活力间有极显著的相关性，表明发芽糙米浆转化谷氨酸的效率可以表征发芽糙米内谷氨酸脱羧酶的酶活力。 存在的问题及拟解决的措施 下一步工作计划 1. 测定10种高GABA含量的糙米及低、中GABA含量的糙米发芽前后游离谷氨酸和总谷氨酸的含量。 2. 测定低中高三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力及游离谷氨酸含量的变化。 导师审查意见     注：每周需要口头向导师汇报研究情况，每一个月必须有课题研究进展的书面汇报 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 。 研究内容及结果 工作时间 2006年3月20日至2007年4月28日 研究内容及结果 1.5高中低三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力、游离氨基酸的变化 内容：选取高（61号，早籼）、中（38号，早粳）、低（65号，中籼）三类品种的糙米，在30℃浸泡6h后于30℃发芽，分别于0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80 h取样，测定其发芽糙米中GABA的含量（mg/100gFW）、GAD酶活力（IU/100gFW）和游离氨基酸含量的变化。 1.5.1 不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量 三种类型的稻米在不同发芽时间下发芽糙米中GABA的含量见图1。糙米在发芽过程中GABA的含量不断上升，当发芽达60h后，GABA的含量可达200～400mg/100g。在发芽的0～16h间，GABA的上升速度缓慢，在24～56h间上升速度不断增加，在发芽56h后，GABA的增量较小。三种类型的稻米在不同发芽时间下发芽糙米中GAD活性见图2。61号和65号样品在发芽的前期GAD酶活性降低，在发芽24h后，酶活力开始增加，而38号样品在发芽过程中GAD的活性变化不大，一直维持在一定的水平；在发芽达64h后，GAD酶活力开始下降。这与发芽过程中GABA的变化趋势是一致的。 糙米在发芽的0～16h间主要是胚芽的萌发；在芽长至0.5～1mm，发芽24h后，胚根开始萌发，在发芽的24～64h间，根会迅速生长至10～20mm，而芽的生长缓慢；在发芽至64h后，根和芽都生长缓慢，并出现分化。可能在胚芽和胚根中有GAD的同功酶，在发芽的前期主要是胚芽中GAD酶的表达，而后期则有胚根中的GAD不断地激活，且在胚芽中的表达较胚根中的表达活性低；即发芽糙米中的GAD在胚芽和胚根中的表达活性及表达时间均有差异。 1.1.1 不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量 将图1中GABA的增量与图2中对应的GAD酶活力作相关性分析，结果表明，GABA的增量与对应的GAD呈显著的正相关性（N=30，F=5.96/α=0.0215）。进一步表明糙米发芽过程中GABA的增加可以解释为GAD的激活，GABA增加速度的快慢可以反映GAD活性的高低，糙米发芽后GABA的增量的差异可能由GAD表达的差异而引起的。 存在的问题及拟解决的措施 下一步工作计划 1. 测定低中高三类品种的糙米发芽过程中游离谷氨酸含量的变化；测定10种高GABA含量的糙米发芽前后游离谷氨酸和总谷氨酸的含量。 2. 对不同品种类型发芽糙米谷氨酸脱羧酶同功酶的鉴定 导师审查意见     注：每周需要口头向导师汇报研究情况，每一个月必须有课题研究进展的书面汇报材料。