环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应xr

环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应xr 生76 王韬 2007030053 环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应 姓名:王韬 班级:生76 组号:7-2组 同组人:袁堂谧 实验日期:2009-11-26 一、 实验目的: 1. 了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。 2. 了解紫外诱变的原理和紫外诱变在育种方面的应用。 3. 练习单菌落划线分离微生物。 二、 实验原理: 1. 微生物对微生物的影响:温度通过影响酶活力、蛋白质和核酸的活性来影响细胞新 陈代谢。微生物群体生长、繁殖最快的温度是微生物生存的最适温度。但不一定是 积累某一代谢产物的最适温度。黏质赛氏杆菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面 颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。 2. 化学因素对微生物的影响:多种化学物质通过不同原理影响微生物的生长。例如重 金属离子可以与菌体蛋白质结合而使之变形。有机溶剂可以使蛋白质和核酸变性或 溶解细胞膜。 3. 生物因素对微生物的影响:许多细菌在生命过程中产生某些特殊的代谢产物如抗生 素。这些物质可以影响其它微生物的生长。青霉素对革兰氏阳性菌的作用强于阴性 菌。链霉素作用于原核生物。 4. 紫外线对微生物的影响: 1) 紫外线具有杀菌作用，主要因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结 构，使其不能行使正常功能。另外，空气在紫外线照射下产生臭氧，也有一定 杀菌作用。紫外线杀菌最强的波长是226-256nm。可见光能激活生物体中的光 复活酶，使形成的二聚体拆开复原，部分或全部消除紫外线的作用，所以杀菌 或诱变后的微生物应避光。 2) 紫外线对细菌生长的作用。我们可以利用个体经紫外线照射后的遗传特性会发 生改变这种特性来进行灭菌或菌种选育工作。紫外线诱变最有效的波长仅仅是 253-265nm，一般紫外线杀菌灯所发出的紫外线波长大约有80%为254nm。 三、 实验材料: 菌源:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌菌液(18h)、粘质赛氏杆菌平板、 一侧 成线的产黄青霉，灰色链霉菌平板各1个 培养基:淀粉培养基平板 实验试剂: 0.5%碘液，1%甲醛，1%过氧化氢， 75%乙醇，95%乙醇， 1%稀释的84 消毒液 实验仪器: 25 ? 、30 ? 、37 ?培养箱等，紫外照射箱 四、 实验步骤: (一) 温度对黏质赛氏杆菌菌落色素形成的影响 1. 用接种环取培养好的粘质赛氏杆菌单菌落，在三个肉汤蛋白胨平板上分区划线接 1 / 7 生76 王韬 2007030053 种，要保证能得到单一菌落。 2. 做好标记，将第一个平板在25?，第二个在30?进行培养，第三个在37?进行培 养。24h后取出，观察不同温度下培养粘质赛氏杆菌生长状况和产生色素情况。 (二) 化学因素对微生物生长的影响 1. 用无菌吸头吸取100μL培养18h的金黄色葡萄球菌菌液于肉汤蛋白胨培养基上，用 无菌涂布棒涂布均匀。 2. 将上述培养皿用记号笔分成六等份，每一等份内标明一种药物名称。 3. 用无菌镊子将小滤纸片分别浸入各种药剂中，然后对号放入培养皿的小区内。注意 不要造成药品交叉污染。 4. 置37?温室培养24h后，观察。比较抑菌圈大小。 (三) 生物因素对微生物生长的影响 1. 用肉汤蛋白胨培养基制成平板，在平板一侧，用接种环取产黄青霉的孢子，在平板 上划一直线接种，置于28?培养48,72h。(已提前准备好) 2. 待形成菌苔后，从距产黄青霉的菌苔边缘5mm处用接种环并分别垂直向外划直线 接种已培养18小时的大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。在37?培养24h， 观察结果。注意取菌不要太多。 3. 用同样的方法做灰色链霉菌的抗菌谱试验。 (四) 紫外线杀菌效果的观察 1. 用无菌吸头吸取100μL培养18h的金黄色葡萄球菌液于肉汤蛋白胨培养基平板上， 以无菌涂棒涂布均匀; 2. 用三张心形、圆环形和蘑菇形的纸条遮住部分平板培养基，打开皿盖，置紫外灯下 照射3min后取出纸，盖上皿盖。 3. 在黑暗中用双层报纸包裹，倒置于37?培养24h后观察结果。 (五) 紫外线对微生物的诱变效应 1. 取摇瓶培养至对数生长期的菌液0.1ml加入0.9ml生理盐水中，进行10倍稀释，依 -1-8次做10,10稀释。 2. 涂布:取各100μl菌液涂平板，每个稀释度涂平板2只。 -6-5-4-33. 紫外线(30W,30cm)处理: 10照射15s ,10照射20s， 10照射30s ,10照射40s、 -2-1-7-810照射50s ,10照射60s。以10和10平板作对照。处理后的培养皿在黑暗中(或 红灯下)用双层报纸纸包好，倒置37?培养，24h后观察并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 结果。 五、 实验结果: 1. 温度对黏质赛氏杆菌菌落色素形成的影响，见下图及表格: 2 / 7 生76 王韬 2007030053 图1. 25?下黏质赛氏杆菌的生长情况。 图2. 30?下黏质赛氏杆菌的生长情况。 图3. 37?下黏质赛氏杆菌的生长情况。 表1. 温度对黏质赛氏杆菌的影响 3 / 7 生76 王韬 2007030053 培养温度 实验现象 现象解释 37? 乳白色菌落 温度较高，导致蛋白质和核酸变性失活，代谢减弱 30? 橙红色(较深)菌落 温度适宜，代谢旺盛，从而积累色素 25? 橙红色(较浅)菌落 温度过低，使酶活力受到抑制，细胞代谢减弱 2. 化学因素对微生物生长的影响，见下图: 图4. 化学因素对微生物生长影响的结果 各区所加试剂及抑菌圈结果如下表: 表2. 化学试剂对微生物生长影响结果 编号 化学试剂 抑菌圈直径(cm) 抑菌能力排序 1 1.4 2 0.5%的碘液 2 2.8 1 1%甲醛 3 1.5%HO 0.8 3 22 4 75%乙醇 5 95%乙醇 6 0.65 4 1%稀释的84消毒液 其中乙醇的两个区4、5区没有产生抑菌圈，可能的原因是乙醇挥发太快，在产生效果 前已经发挥完，故没有产生抑菌效果。3区纸片发生了移动，其移动路径上也产生了抑 菌效果，如图中箭头所示部位。 3. 生物因素对微生物生长的影响 图5. 左图为泾阳链霉菌的抗菌结果，右图为产黄青霉的抑菌效果。两图接种的试验细菌从上之下分别为大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。左图的抗菌效果从强到弱为枯草 4 / 7 生76 王韬 2007030053 杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。右图的抗菌效果从强到弱为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌。 4. 紫外线杀菌效果 图6. 紫外线杀菌效果。 可以看到被纸片遮住的地方细菌生长良好，而暴露在紫外线下在区域没有细菌生长。可以紫外线的杀菌效果良好。其中蘑菇形的有菌落区域的左边为黄色。推测为杂菌。剪纸时长时间握住这个部位，造成了杂菌污染。 5. 紫外线对微生物诱变的影响 表3. 紫外线对微生物诱变的影响 处理后的活菌数 稀释度 照射时间(s) 平均值 应有菌数 存活率 致死率 1 2 -1610 60 无法计数 无法计数 6.0×10 -2510 50 33 21 27 3.86E-05 ?100% 6.0×10 -310 40 3 1 2 60000 2.86E-05 ?100% -410 30 0 1 1 6000 1.43E-04 ?100% -510 20 2 11 7 600 1.00% 99% -610 15 0 1 1 60 1.43% 98.57% -710 0 4 0 2 -810 0 0 1 1 处理后活菌数1，处理后活菌数2平均值,; 2 78,,10，10，10稀释度为菌数稀释度为菌数,应有菌数-7-n2，10，此处n为稀释度中10的指数; 5 / 7 生76 王韬 2007030053 平均值存活率,应有菌数 致死率,1,存活率 表4. 紫外线对各浓度枯草杆菌的诱变产生透明圈情况 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 编号 6.0 5.8 4.2 5.0 6.0 5.5 6.2 6.8 7.0 5.5 6.8 15.0 6.5 透明圈直径(cm) 3.3 3.4 2.2 3.2 4.5 3.5 3.5 3.3 5.0 3.6 5.0 3.1 6.0 菌落直径(cm) 1.818 1.706 1.909 1.563 1.333 1.571 1.771 2.061 1.400 1.528 1.360 4.839 1.083 HC值 其中HC值最大的菌落图如下: 图7. HC值为4.839的菌落。其HC的值明显高于其他菌落，可见其突变效果良好。 六、 实验讨论: 1. 温度对黏质赛氏杆菌菌落颜色的影响实验中，30?和25?实验条件下的菌落颜色只 有细微差别。其可能的原因接种时两个板的接种量不同，25?原细菌数要多一些， 那么即使在不适宜的温度下，其产色素能力还是可以和30?的细菌相比拟的。另一 个原因是培养时间较短，细菌色素积累量没有达到可以区分的量。因此可以延长细 胞培养时间。 2. 根据抑菌圈的大小，可以推测各化学物质的抑菌能力。抑菌能力从强到弱的顺序为: 1%甲醛，0.5%的碘液，1.5%HO，1%稀释的84消毒液。无法判断乙醇的抑菌能力，22 因为未产生抑菌圈。但这并不能说明乙醇没有抑菌能力。实验结果可能和乙醇的物 理性质有关。乙醇是挥发性物质。尤其是在高浓度下，其挥发性能更强。没有发生 抑菌，很可能是因为乙醇很快挥发掉了，所以没有起到抑菌作用。 1) 乙醇的杀菌机理是使蛋白质变性，破坏细菌细胞壁，对微生物酶系统破坏。 2) HO利用其强氧化性，使细菌表面细胞膜和细胞壁坏死，细胞液外渗而达到杀22 菌作用 3) 甲醛可以使蛋白质变性和烷基化。 4) 84消毒液的主要成分是次氯酸钠，起杀菌机理是使蛋白质凝固。 5) 碘可以使蛋白质变性。 3. 从生物因素对微生物生长的影响实验中可以看出，链霉素和青霉素的抗菌谱基本上 是互补的。青霉素抗菌谱主要是革兰氏阳性菌和部分阴性菌而链霉素则相反。从它 6 / 7 生76 王韬 2007030053 们的作用机理也可以推断出它们的抗菌效果。青霉素抑制肽聚糖的形成。肽聚糖为 革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分。所以青霉素主要对革兰氏阳性菌其作用。链霉素 作用于核糖核酸30S亚基。核糖核酸30S亚基为原核生物核糖体的成分。所以链霉 素只作用于原核生物。链霉素对三种原核生物影响程度不同，是因为三种生物对核 糖体的依赖程度不同。 4. 紫外诱变实验中，存活率和致死率数据只能作定性上的分析。因为可用数据量很小， 实验误差很大。但是还是可以得出紫外线照射时间与存活率负相关的结论。对照组 中的菌落的HC值接近于1，而诱变组出现了HC值高达4.839的菌落。则该菌落已 突变。其他几组的HC值在1.3至2.0范围内，可见这些细菌也发生了不同程度的突 变。本实验数据量太小，所以无法反应出突变率。理论上突变率和照射时间正相关。 在诱变时需要把握致死率和突变率的平衡点。也就是要掌握好紫外线照射时间。过 长则细菌存活量少，过短则突变率低。 七、 参考文献: 陈金春，陈国强等，微生物学实验指导，清华大学出版社，2005 7 / 7