【DOC】磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响

【DOC】磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响 磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成 熟的影响 安徽农业科学,JournalofAnhuiAgIi.Sci.2012,40(5):2724,2745责任编辑刘赘责任校对卢瑶 磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响 陈明,朱云干,卞桂华,(1.江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州2253oo;2.扬州大学动物科学院,江苏扬州22500o) 摘要[目的]探讨磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞成熟的影响.[方法]水牛卵母细胞分成3组,分别在含0,50, 100I~mol/L的milfinone的成熟液中培养16h后,每组的一半卵母细胞用来染色,检验核成熟情况;另一半卵母细胞再在不合milrinone 的成熟液中培养l2h,挑选形态正常的卵母细胞受精后培养.[结果]添加5O和100~ol/Lmilfinone的成熟液成熟的卵母细胞的生发 泡破裂(GVBD)比率分剐为25.9%和l2.1%,显着低于对照组(76.9%);但另一半卵母细胞再培养,受精后试验组(50,100I~mol/Lmil. finone)的分裂率(59.3%和61.2%)和囊胚率(35.9%和31.1%)与对照组(56.7%和28.8%)相比均无显着性差异(P>0.05).[结 论]milrinone对水牛卵母细胞的成熟具有明显的抑制作用,成熟抑制解除后水牛卵母细胞仍可保持较高的发育潜能. 关键词水牛;卵母细胞;米力农;体外成熟;体外受精 中图分类号Q959.842文献标识码A文章编号 0517—6611(2012)05—02724一O1 EffectsofPl嘲?_斑幽 eraseInhibitorontheinVitroMaturationofBuffaloOocytes c脚M氅辑 (JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege,Taizhou,Jiangsu225300) A】 [ObjectiveJTheaimwastodiSCllSStheeffectofphosphodiesteraseiififibitormilfinoneonbuffalooocytesmaturation.『Method]Bu?a一 1oesweredividedinto3groups,then,wereculturedinmaturedliquidwith0,50and100la~nol/Lmilrinonefor16hrespectively, thehalfof ooeytesineachgro叩 weredyedtoverifytllematurationcondition;theotherhalfofoocyteswereculturedinmaturedliquidwithoutmilrinonefor 12hrespectively,山 enormaloocyteswereselectedandfertilizedforculture.[Result]GVBDrateofoocytesaddingwith50and10oi~mol/Lnail— flnB~einmaturationmediumwere25.9%and12.1%,respectively,lowerthanthatofcontrolgroupsignificantly(76.9%);however,theother h丑连 ofooeytesineachgroupwerefertilized.nleirfertilizationcleavagerate(59.3%a nd61.2%)andblastocystyield(35.9%and31.1%)of buffalooocytesculturedinthematurationmediumwithmilrinoneweresimilartothoseofcontrolgroupoocytes(56.7%and28.8%.P>0.05). IConclusionIResultsindicatethatmilrinonecanobviouslyinhibitsthematurationofbuffalooocytes.Buffalooocytestreatedwithmilrinonecan resumemeioticmaturationandmaintainhighdevelopmentalcompetence. KeYwordsBuffalo:Ooeytes:Milrinone:Invitromaturation:Invitrofertilization 腺苷-3’,5’一环化.磷酸(cAMP)在细胞减数分裂中的 作用已被许多研究所证实,但卵母细胞内cAMP的水平 受何种机制调控仍未见报道.目前科研人员通过抑制卵母 细胞的自发成熟来控制核成熟,从而达到提高胞质成熟和体 外卵母细胞发育的目的.为了探讨水牛卵母细胞体外成熟 的机制,笔者通过PDE亚型特异性的抑制剂米力农(milri— none)对水牛卵母细胞减数分裂成熟的影响进行研究,以期 为建立一套提高卵母细胞体外成熟质量的成熟培养体系奠 定基础,同时为改进卵母细胞成熟的体外培养系统提供 依据. 1材料与方法 1.1材料新鲜水牛卵巢,取自泰州市屠宰场,置于盛有37 的生理盐水保温瓶中,2h内送至实验室;TCM一199(GIB— CO),Milrinone(Sigma). 1.2培养液配制卵巢保存及运输液:含有K,ca2,M2 的生理盐水;洗卵液:TCM一199+5.0mmol/LNaHCO3+5 mmol/LHepes+2%发情牛血清(OCS);基础成熟液(M): TCM一199+26.2mmol/LNaHCO3+5mmol/LHepes;Milri— none储存液:nailfinone用DMSO溶解,贮藏浓度为20ram, DMSO在培养液中的终浓度不超过0.1%,于一20?保存. 试验中所有培养液均添加60mg/L的青霉素和100mg/L的 链霉素.所有试剂均用孔径0.22tun的微孔滤膜过滤消毒. 基金项目 作者简介 收稿日期 国家自然科学基金资助项目(30460090). 陈明(1978一),女,江苏泰州人,讲师,硕士,研究方向:生物 工程.}通讯作者,副教授,博士,研究方向:动物生物工 程.E?mail:bianguihua@163.com. 2011.1l3 1.3卵母细胞的采集与成熟培养用带12号针头的l0rnl 注射器抽取水牛卵巢上2—6rr帅卵泡中的卵母细胞.在体 视显微镜下收集卵母细胞,除去其中的裸卵和透明带变形卵 后用洗卵液清洗2次,置于含1.5rnl成熟培养液(M)的玻璃 平皿中(培养密度约100个/1.5m1),然后在38.5?和最大 饱和湿度的培养箱中进行体外成熟培养24h. 1.4卵母细胞的体外受精将细管冷冻精液在37?水浴 中解冻,悬浮于改良的Tyrode~液30min.吸取上层活精子, 离心5min(1500r/min),去上清,收集的精子留待体外受精 用.卵母细胞成熟培养后,在受精液中洗涤2次,并转移至 覆盖有石蜡油的受精液滴中,每滴以10—15个卵母细胞为 宜.加入一定量经上述处理的精子,使精子在受精液滴中的 最终浓度约为1×10/ml.最后,将其放入CO:培养箱中进 行体外受精. 1.5早期胚胎的体外培养将体外受精24h后的卵母细胞 置于颗粒细胞单层中培养24h或48h,检查分裂情况,每隔 24h半量换液,第6—9天检查囊胚发育情况. 1-6卵母细胞核质成熟的评定通过生发泡是否破裂判断 核成熟情况,以受精后胚胎的发育能力评定胞质成熟的 质量. 1.7试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 将水牛卵母细胞分成3组,分别在含O,5O, 100mol/Lmilrinone的成熟液中培养16h后,每组一半卵 母细胞用l%的乙酸间苯二酚蓝染液染色后镜检,以生发泡 破裂(GVBD)作为卵母细胞核成熟的标志;另一半卵母细胞 再在不含milrinone的成熟液中培养12h,挑选形态正常的卵 (下转第2745页) 4O卷5期文毅等四川雅安雨城区不同果园土壤入渗特征研究2745 ~uthemChina:I.Experimentandanalysis[J].JournalofZhejiangUni— versity(SCIENCE),2O05,6B(5):331—337. 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(上接第2724页) 母细胞受精后培养,最后进行受精其胚胎发育能力评定. 1.8数据处理试验数据结果用SAS统计软件进行方差统 计分析确定差异的显着性,P<0.05确定为差异显着. 2结果与分析 由 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1可知,添加50和100lxmolfLmilfinone的成熟液 成熟的卵母细胞的GVBD率(分别为25.9%和12.1%)显着 低于对照组(76.9%);但试验组另一半卵母细胞经再培养, 受精后分裂率(59.3%和61.2%)和囊胚率(35.9%和 31.1%)与对照组相比(56.7%和28.8%)均无显着性差异. 表1Milrinone的浓度对水牛卵母细胞核成熟和体外受精能力的影响 注:I司列内不同字母表示差异显着性(P<0.05). 3结论与讨论 卵母细胞的质量是影响核移植及体外授精成功率的一 个重要因素.然而哺乳动物卵母细胞的核质成熟存在明显 的不同步性,如何控制卵母细胞的核成熟,延长成熟培养时 间,使卵母细胞质得以充分成熟成为目前卵母细胞体外成熟 的研究热点.Milfinone是近年来研究较多的一种磷酸二酯 酶的抑制剂,可通过抑制PDE活性,阻止cAMP的降解,进而 提高卵母细胞内cAMP水平来维持卵母细胞成熟分裂静止 状态.有研究表明,通过PKB/Akt调节磷酸化过程的 PDE3A激活在控制哺乳动物卵母细胞中PDE3A活性方面具 有重要的作用,通过其活性变化调节卵母细胞的成熟.在 进行卵母细胞体外培养研究发现cAMP及其类似物db. cAMP,磷酸二酯酶的抑制物,腺苷酸环化酶和能激活腺苷酸 环化酶的物质(如forskolin)等,均能抑制GVBD的发生,如 PDE3抑制剂0RG9935阻滞了灵长类动物,恒河猕猴和人 卵母细胞减数分裂的恢复.该次试验亦得出同样的结论, milfinone能抑制水牛卵母细胞的核成熟. 磷酸二酯酶抑制剂处理的体外成熟小鼠,牛卵母细胞用 于体外受精时,可显着提高受精率,胚胎的发育能力及胎儿 的出生率一.Thomas等在含FSH的成熟培养液中添加 PDE3的抑制剂milrinone(100pjnol/L)和PDE4的抑制剂ro- lipram均显着提高了牛卵母细胞成熟培养28h后体外受精 的囊胚发育率,并同时证实2种PDE抑制剂均能延长卵母细 胞与卵丘细胞之间的间隙联结保留时间,使成熟分裂的恢复 延迟.研究在Thomas等的工作基础上,比较了不同浓度(0, 50,100I~mol/L)PDE3的抑制剂milfinone对水牛卵母细胞核 质成熟的影响.由于milnnone对核成熟的作用较强,所以需 在无milfinone的成熟液中培养一段时间,以便让其完成最后 的成熟阶段.Nogueira等曾用该方法显着提高了小鼠卵 母细胞体外受精后的分裂率和桑椹胚发育率.但该次试验 并未得出同样的结果,可能是由于随着成熟培养时间的延 长,卵子老化降低了卵母细胞的发育能力,但抑制卵母细胞 16h已经改善了卵母细胞老化这一致命性影响,且未表现出 高的分裂率和囊胚率,这有待于进一步对milfinone作用机理 的研究.此外,抑制剂对核成熟抑制的同时是否会影响水牛 胞质中细胞器的生理功能也尚需进一步深入研究.该次研 究结果虽然未能证实milfinone能提高水牛卵母细胞的体外 成熟质量,但足已证明其对水牛卵母细胞的核成熟抑制作用 是可逆的,抑制作用解除后水牛卵母细胞可正常成熟. 参考文献 [1]EPPIGJJ,WARD—BAILEYPF,COLEMANDL.Hypoxanthineandaden- osineinnicheovarianfollicularfluid:Concentrationsandactivityin maintainingoecytemeioticarr~tEJ].BiolReprod,1985,33:1041—1049. 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