高效乳酸菌增殖培养基的筛选

高效乳酸菌增殖培养基的筛选 第12卷第4期 2003年12月 淮海工学院 JournalofHuaihaiInstituteofTechnology Vo1.12No.4 Dec.2003 文章编号:1008—3499(2003)04—0059—04 高效乳酸菌增殖培养基的筛选 刘云鹤 (淮海工学院食品工程系.江苏连云港222005) 摘要:为了获取高效廉价的乳酸茵增殖培养基,通过正交试验及混料回归试验,确定了培养基的组 成成分以及各成分的配比,其配方为2蔗糖,0.58蛋白胨,1O.92大豆粉(均为质量分数).在上 述增殖培养基中添加质量分数0.5的KH.PO一Na.HPO,可增强其缓冲能力,促进细胞的积累,每 mL培养液中发酵乳杆菌和植物乳杆菌细胞的数量可分别达到6.O2×1O.和5.88×1O..适用于大规 模生产乳酸茵发酵荆. 关键词:乳酸茵;发酵荆;增殖培养基 中图分类号:TQ921.3文献标识码:A ThePreparationofLacticAcidBacteriaPowderStarter IIUYun,he (Dept.ofFoodEngineering.HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China) Abstract:Inordertogetlacticacidbacteriastarterwithfllargenumberoflivecells,themedium andcultureconditionswerestudiedinthisexperiment.Resultsindicatethatthecompositionofthe mediumforLactobacillusfermentumandLactobacillusplantrumis2sucrose,0.58peptone and10.92soybeanpowder.Alargenumberoflacticacidbacteriacellscanbegainedinshorter timewith0.5KHzPO4一 NazHPO4added.Theselectedmediuminoculatedwith3Lactobacillus 尼 rmentumandLactobacillusplantrumarecultivatedat38Cfor18h,andthecellconcentrations canreach6.02×10.and5.88×10.permillilitermediumrespectively.Suchflmethodcanbeused inlarge—scaleproductionoflacticacidbacteriastarter. Keywords:lacticacidbacteria;starter;medium 0前言 脱脂乳中营养成分丰富,可满足乳酸菌生长繁 殖的需要,是乳酸菌增殖培养的主要原料,但是由于 其成本高,所以在大规模乳酸菌增殖培养中不宜大 量使用.大豆,玉米,花生中也含有丰富的营养物质, 可以用作乳酸菌的培养基.一些蔬菜如胡萝卜,黄 瓜,番茄等也可作为乳酸菌增殖培养的培养基,但是 其中的营养物质如碳源和氮源的含量不够充足,需 大量添加,使生产操作过于复杂.本试验主要对筛选 高效廉价的乳酸菌增殖培养基进行研究. 收稿日期:2003—08—29;修订日期:2003—1I-14 1材料与方法 1.1菌种 发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum(L.厂),植 物乳杆菌Lactobacillusplantrum(.户)由湖南农业 大学食品科技学院食品化学与微生物实验室提供. 1.2培养基 (1)MRS液体培养基:蛋白胨10g/L;酵母提 取物5g/[;柠檬酸二铵2g/L;葡萄糖20g/L;牛肉 膏10g/I;吐温8O1mL/L;KzHPO42g/L;MgSO’ ?7H2O0.58g/I;MnSO4?4HzO0.25g/L.pH 60淮海工学院2003年12月 6.4,用于制备菌种的种子液. (2)MRS固体培养基:在MRS液体培养基中 加入质量分数1.5的琼脂,用于菌种保藏,活化. (3)乳酸菌增殖培养基:2蔗糖;0.58蛋白 胨;10.92大豆粉;0.25的磷酸二氢钾;0.25的 磷酸氢二钠(以上均为质量分数).pH为6.7. 论文提及的培养基均在121.C下灭菌20min. 1.3其他原料 (1)大豆粉:在沸水中煮沸30min,用纱布粗滤 后,4000r/min离心15min,除去上层脂肪和底层 渣子,留清液,调节其pH至3.5以除去酸不溶性物 质,再离心,将所得清液的pH调回至6.5,用于制备 增殖培养基. (2)玉米浸提液:用质量分数1的亚硫酸钠浸 泡玉米24h,取清液备用. (3)酵母自溶物:称取2g干酵母一研散一加 50mI水一53?,48h处理一稀释至质量分数为 1一煮沸10,15min一冷却一调pH为3.5一沉 淀,取上清液一调pH为7.0,7.4一灭菌.L1] 1.4乳酸菌细胞总数的测定 在乳酸菌镜检涂片的特殊染色法L2]的基础上作 一 些改进:固定涂片的面积和涂布培养液的量,以计 算每mI培养液中的细胞数目.具体操作方法为:用 微量进样器取乳酸菌培养液的样品1L,均匀涂在 血球计数板的光滑区内,涂片固定后用质量分数 0.2的甲苯胺蓝染色液染色2min,然后用质量分 数1的乙酸溶液脱色30S,立即用水冲洗,干后于 显微镜下计数.按照式(1)计算出每mI培养液中乳 酸菌细胞的数目. f一4×10?M?S,(1) 其中:f一培养液中细胞的浓度(个/mL);M一血球 计数板上每小格中的细胞数目(个);一血球计数 板光滑区的面积(mm). 1.5乳酸茵培养液吸收光谱图的测定 用未接种的培养液调节分光光度计的零点,在 波长380,780nm之间测定培养18h后的L.厂和 L.P培养液的吸光度A.以波长为横坐标,吸光度A 为纵坐标,作出曲线以找出细胞的最大吸收波长. 1.6培养基成分的筛选 选择碳源(A),氮源(B),生长因子(C)和无机 盐类(D)为试验因素, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 L9(3)正交试验,以获 取培养基的最佳组成.其中培养基备选材料是以用 于乳酸菌增殖培养的MRS培养基的营养组成为依 据,参照食物成分表引,经预备试验确定的.该试验 中各种营养成分的量为:碳源2,氮源11%,生长 因子0.5,无机盐类0.5(以上均为质量分数). 正交试验的因素和水平如表1所示. 表1 Table1 培养基组分正交试验因素水平表 Thefactoriallevelsoforthogonal testformediumcomposition 将活化好的菌种以体积分数3的接种量接入 培养基(按照L.(3)正交试验的设计配制而成),于 38’C培养18h.然后,用1.4的方法对乳酸菌进行 计数,按式(1)计算培养液细胞浓度. 1.7缓冲盐的选择 在增殖培养基中分别加入KHPO.一NaHPO. 和CaCO.,以不加缓冲盐的增殖培养基为对照,置 于38?培养箱中培养18h后,用1.4的方法对乳 酸菌计数,并计算细胞浓度. 2结果与分析 2.1乳酸茵培养液最大吸收波长的确定 从图1可看出,在波长540nm处L.厂和L.P 的吸光度最大.以下试验中,用在540nm处测定的 吸光度表示细胞浓度的相对大小. 图1L.P与L.,的吸收光谱图 Fig.1TheabsorptionspectrogramofL.PandL.f 2.2增殖培养基配方 2.2.1培养基成分的筛选表2为培养基成分筛 选试验结果,经分析可知4个因素对L.P和L.厂的 增殖均有影响. 第4期刘云鹤:高效乳酸菌增殖培养基的筛选61 根据极差R,值的大小可判断出碳源(A),氮源 (B)的影响较显着,无机盐类(D)和生长因子(C)的 影响相对较小.这是因为乳酸菌属于化能异养型微 生物,缺乏对多种有机化合物的合成能力,而且其蛋 白酶和淀粉酶的活性极弱,因此必须从外界吸收多 种小分子营养物质如蛋白质的降解产物,单糖和寡 糖等,才能较好地生长发育.而乳酸菌生长所需要的 大部分无机盐种类虽多,但数量少,大部分都可以从 有机营养物质中获得.微生物生长所需的生长因子 在大豆粉和蛋白胨中也较丰富.因此,外加生长因子 和无机盐对细胞积累影响较小.表2显示,适合?’ 和L.细胞生长的培养基的成分组合为AsBCDs, 考虑到无机盐和生长因子对两种乳酸菌细胞的积累 影响较小,故在培养基中不添加使用.因此增殖培养 基组分最佳组合为A.B,即蔗糖,蛋白胨,大豆粉. 2.2.2各成分的配比本试验按混料回归试验设 计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 进行[4],以获得培养基中各成分的较优配比. 根据预备试验,确定碳源(蔗糖),氮源(大豆粉+蛋 白胨)和水这3种成分的百分比最小值n.,分别为: 口一0.02,口2=0.05,口3—0.8,其编码值z与实际成 .上 分z.的转换公式为:一啦=(1一?嘶j,/7,可计算ll 出当z=0,0.5,1时Z的实际取值.表3为成分取 1蕴口厂r 值编码. 表3单纯形格子设计成分取值编码表 Table3Thearrangementofthecoding 按表4配制6种培养基,121’C下灭菌20min 后以体积分数3的接种量接种,38C培养18h,测 量吸光度A.每个析因点作3个重复,取其平均值作 为试验结果.结果见表4. 表4培养基成分配比结果 Table4Theratioofmediumcomposition 62淮海工学院2003年12月 (1)关于 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 变量的回归方程.将表4结构矩 阵中的各析因点代人效应函数方程 Y----bll+b22+b33+6l2l2+ bl3l3+b2323, 便可得系数b. 对L.P,bl一0.315,b2—0.837,b3—0.554,bl2一 一 1.632,bl3一一1.31,b23一一1.766; 对L.厂,bl一0.281,b2—0.802,b3—0.473,b2— 0.254,bl3—0.24,b23—1.306. 由此求得关于规范变量的3因素2次多项式回 归方程为 Y=0.315xl+0.837x2+0.554x3— 1.632xl2—1.31xl3—1.766x22, Y一0.28lxl+0.802x2+0.473x3+ 0.254xl2+0.24xl3+1.306x22. (2)利用回归方程对配方比例寻优组合.将 值分别代人得到的回归方程,算出Y值.经比较,Y 值最大的一组组合为试验中的第6组,即为最优组 合.培养基成分最佳配比为2蔗糖,l1.5大豆粉 与蛋白胨的混合物((大豆粉):m(蛋白胨)一95 :5),水86.5(均为质量分数). 2.2.3缓冲盐的选择 7ooE+O9 6.00E+09 5.00E+09 400E+09 3.00E+09 建 星2.00E+09 100E+09 0.00E+00 ABC A一空白;B—KH2PO4一NazHPO;C—CaC03 图2不同缓冲盐对,.,和L.P细胞积累的影响 Fig.2TheeffectofdifferentbuffersaltonL.f andL.Pcellaccumulation NaHPO缓冲体系能够部分中和乳酸菌在生长过 程中产生的酸,可一定程度上维持发酵液pH的稳 定,延长对数生长期,从而促进L.厂和L.P的积累. 虽然CaC0.也可以中和细胞生长过程中产生的酸, 但是细胞积累量相对较少.这可能是因为CaCO.与 酸中和后,游离出一定量的Ca抖,其在某一浓度下 会促进细胞的增殖,而超过此浓度时会抑制细胞的 增殖j.空白组的细胞积累量最少. 综合以上两组试验的结果,选择KHPO一 NaHPO添加到增殖培养基中以增强培养液的缓 冲能力. 3结论 增殖培养基的配方为2蔗糖,0.58蛋白胨, 10.92大豆粉,0.5KHPO一NaHPO(均为质 量分数).采用上述增殖培养基培养(温度为38_C, 接种量体积分数为3)L.厂和L.P,18h后每mI 培养液中细胞的数量分别达到6.02×10.和5.88× 10..该培养基增殖效果好,价格比较低廉,适合应用 于大规模生产乳酸菌发酵剂. 参考文献: [1]黄秀梨.微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版 社,1999. [2]吕加平.酸奶中乳酸菌镜检涂片的特殊染色法[J].微 生物学通报,1999,26(4):281—282. [3]俞俊棠,唐孝宣.生物工艺学[M].上海:华东化工学院 出版社,1991. [4]刘魁英.食品研究与数据分析[M].北京:中国轻工业 出版社,1998. Is]中国预防医学科学院.营养与食品卫生研究所.食物成 分表[M].北京:人民卫生出版社,1999. [6]凌代文.乳酸菌分离鉴定实验方法[M].北京:中国轻 工业出版社,1998. 作者简介:刘云鹤(1976一).女.黑龙江齐齐哈尔人.淮 从图2中可看出添加KH2PO一Na2HPO后,两海工学院食品工程系教师,硕士,主要从事食品发酵方面的 种乳酸菌的细胞积累量最大,主要原因是KHPO一研究. 一_—蕊可r—_? (责任编辑:褚金红)