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抗生素发酵染菌原因及解决方法.doc

抗生素发酵染菌原因及解决方法

我们不离不弃上
2019-03-15 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《抗生素发酵染菌原因及解决方法doc》,可适用于农林牧渔领域

浅谈抗生素发酵染菌原因及预防方法生产抗生素通常采用微生物纯种培养培养过程中只允许特定的微生物生长如果发酵过程中除抗生素产生菌以外还有其他微生物存在(染菌)就会影响抗生素产量和质量。抗生素发酵在生产中常常因操作环节复杂而更容易染菌笔者在长期的生产实践中积累了一些经验对避免发酵染菌及查找染菌原因具有一定的指导作用。染菌的原因及预防方法摇瓶(斜面)种子带菌导致一级种子罐染菌摇瓶(斜面)种子制备过程中如果存在母瓶(母斜面)培养基和子瓶(子斜面)培养基灭菌不彻底或菌种操作人员在净化工作台中进行母瓶(母斜面),子瓶(子斜面)接种及并瓶时无菌操作不规范或摇瓶种子培养环境不洁净等现象就会造成摇瓶(斜面)种子带菌而导致一级种子罐染菌。预防方法:菌种制备过程中首先要保证配制的培养基没有较大颗粒培养基灭菌时要保证蒸汽流动,做到压力计和温度计的准确一致性防止假压形成。为防止灭菌后培养基二次染菌应尽量做到培养基即灭菌即使用。无菌操作时保证无菌室用前彻底灭菌所用器具不带菌。操作时无菌物品在上风处带菌(或可能带菌)物品在卜风处操作人员少说话避免咳嗽、打喷嚏及其他大幅度动作。无菌室管理按照GMP有关洁净区的要求进行定期检测沉降菌、浮游菌。摇瓶间按洁净区管理。摇瓶间是摇瓶种子母瓶、子瓶培养的场所在培养过程中瓶塞上往往会附着尘埃。在接种、并瓶等无菌操作过程中拔瓶塞时灰尘很容易落进瓶内造成种子带菌。要想实现摇瓶种子无杂菌保持摇瓶间的清洁是非常关键的。应当把摇瓶间当做洁净区区进行管理:每日坚持用干净湿抹布擦拭摇瓶间的地而及墙而在充分消除对培养种子影响的情况不定期用消毒液如双氧水等对摇瓶间进行消毒。一级种子管接种操作不当染菌火焰接种会导致一级种子罐染菌种子罐接种时除按要求进行室内消毒外还需要消毒人员与接种人员密切配合快、准、稳地完成操作过程否则易导致接种失败。预防方法:进行一级种子罐接种:一是压差接种法二是零磅接种法。当采用零磅法接种时罐压瞬时为零外界空气就有可能从设备的泄漏处(如轴封等)及接种口进入罐内造成染菌。因此保持一级罐接种区的洁净度也是减少染菌的有效方法应当做到:一级种子罐要有单独的区域同其他生产区隔离保持一级种子罐区的环境卫生一级种子罐区门窗日常应处于密闭状态每次接种前用消毒液喷雾消毒环境定期用高锰酸钾熏蒸消毒。有些公司将一级种子罐的接种口放置在无菌室内的净化工作台前效果良好。蒸汽质量造成的染菌由于受各方面因素影响蒸汽质量波动很大。有时蒸汽中冷凝水含量很高总蒸汽压力较低并且压力波动很大温度低这种蒸汽属于湿饱和蒸汽灭菌效果较差很容易造成染菌。预防方法:在生产进度允许的情况下可采取空消的办法排除蒸汽中的一部分冷凝水待蒸汽相对干燥一些后再正式进罐消毒灭菌。也可以再进罐灭菌之前开启各个蒸汽灌录上的冷凝水阀门排冷凝水待蒸汽中含水量减少之后再进罐。以上只是应急措施要从根本上解决蒸汽中冷凝水的问题还必须从蒸汽锅炉的设计容量、系统管路的合理安装、管道的保温等方面去解决。需要特别注意的是消毒蒸汽管路不能连接非消毒设施如采暖设备职工澡塘的蒸汽否则会造成发酵车间蒸汽压力下降和波动甚至有菌物料和蒸汽的串连因这种原因造成的染菌在很多厂家都发生过。空气系统引起的染菌过滤器失效会导致染菌因空气系统带菌而导致罐染菌的机率较高。空气系统容易出现的问题是:无菌空气带油带水、空气过滤器质量和高效滤芯的安装质量等几个方面。无菌空气中带油多来自往复式空气压缩机上解决这个问题首先应从采用无油润滑空压机着手。无菌空气带水主要是由压缩后的高温空气经突然冷却后产生的。除水设备泄漏、设计不合理或是失效是空气带水的主要原因。预防方法:增加必要的除油除水设备。特别要注意定期排水尤其是湿度大的阴雨天气。采用无油润滑的空压机从根本上解决。若无法改造可以在总空气过滤器上填充活性炭或玻璃棉减少油雾阻力。空气过滤器滤芯要采用质量较好的厂家的产品。使用尘埃粒子计数器等检测仪器和生物鉴定方法对过滤器是否失效进行准确、及时的判断安装高效过滤器要注意以下几点:高效过滤器的灭菌管路一定要经过减压、温压、粗滤处理高效过滤器的空气进出口管路上安装监测口安装前一定要仔细检查卡口与O形圈的配合尺寸一般一个季度做一次检查发酵过程中染菌后要根据菌型判断杂菌的来源不能草率的拆卸高效过滤器。降温设备泄漏和堵塞发酵罐夹层和蛇形管的穿孔是造成染菌的主要原因之一。冷水阀门内漏、夹套(蛇管)排水阀门堵塞也是造成染菌的主要设备因素。预防方法:在冷却设备制作过程中应当选用不锈钢材质未原料进行冷却设备的加工制造。冷却设备制造结束应当进行严格个试漏检查并应当进行射线探伤检查并拍片。发酵车间应当建立冷却设备的定期检查及试压、试漏制度。发酵罐必须每批下罐进行罐内设备的检查防止蛇形管定位卡松动而造成穿孔泄漏。培养基带菌导致罐染菌培养基颗粒过大会导致灭菌不彻底培养基灭菌操作不到位导致灭菌不彻底培养基在灭菌过程中对预热时间、蒸汽阀门的开度、灭菌温度、灭菌压力和泡沫控制等都有严格要求一个环节出现问题就容易导致染菌。预防方法:培养基配制时应充分搅拌,并在输料管道上安装管道过滤器以防止大颗粒固形物进入种子罐造成培养基灭菌不彻底。若种子罐较小配料量较小的情况下最好将原料过筛可有效防止此种情况。灭菌前全面检查设备、消除灭菌死角根据设备大小决定灭菌预热时间培养基灭菌时其蒸汽压力不得低于MPa,根据培养基初始温度的不同决定阀门的开启程度。灭菌过程中应保证与培养基相接触的管道大进蒸汽与培养基不接触的管道小进蒸汽防止出现假压要同时观察压力表和温度表二者应符合对应关系如有明显差异可根据经验判断失灵者(一般以温度计为准)。灭菌过程中进汽阀门应逐渐增大排汽阀门应逐渐关小保压灭菌时应保证压力温度稳定。染菌的检查、原因分析染菌的检查与判断在发酵过程中对杂菌污染的及早发现及时处理是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染目前常用方法主要有以下几种:显微镜检查通常用革兰氏染色法染色后在高倍显微镜下观察根据生产菌与杂菌的特征区别判断是否染菌。平板划线培养或斜面培养检查法先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏度保温至少h检查无菌即可使用。将需要检查的样品在无菌平板上划线分别置摄氏度、摄氏度培养以适应嗜中菌和低温菌的生长一般在h后即可观察(但准确率较低)。培养基(PH):葡萄糖牛肉膏蛋白胨氯化钠 琼脂肉汤培养检查法将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中放置摄氏度和摄氏度分别培养h进行观察并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌此时使用生产菌作为指示菌。葡萄糖酚红肉汤培养基(PH):牛肉膏葡萄糖氯化钠蛋白胨酚红溶液。用以上的检查方法检查未发现污染还不能肯定未被污染。除以上方法外还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌如溶解氧急剧降低、PH值剧烈变化、排气中CO含量和菌体酶活力等变化来判断。注:有很多情况下发酵培养基因使用酵母粉、玉米浆等含有大量菌体的物料配置培养基显微镜下观察时难以判断此时应遵循的一个原则是若培养基染菌其菌量应逐渐增加若菌量未增加且菌型与培养基中所含菌形态一致的应该不是染菌。需要注意的是开始染菌时间的判定和菌型的判定是非常关键的。是接种前染菌还是接种后染菌、是补料前染菌还是补料后染菌、是补哪种料哪批料后染菌、染的是耐热菌型还是非耐热菌型、染的单一菌型还是混合菌型都是工艺人员判断染菌原因的依据。取样都是在开放环境下进行的难免有误差出现为了避免误差可以增加取样的频率和数量特别是种子罐系统万一出现难以判断的情况较多的样品可以增加判断的依据。发酵染菌原因分析在发酵染菌之后必须分析染菌原因总结发酵染菌的经验教训把发酵染菌消灭在发生之前防患于未然是积极制服发酵染菌的最重要措施。造成发酵染菌的原因很多但总结归纳起来其主要原因有:无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。在发生染菌后都要仔细利用显微镜观察培养基无菌斜面和肉汤(前期染菌要镜检供种方的无菌样)参考表一并参考以下方法进行分析找出原因杜绝污染。表各种微生物生长最适温度、pH及致死温度、致死时间范围微生物最适温度℃pH致死温度℃致死时间tmin酵母菌霉菌球菌长短杆菌芽孢杆菌     从染菌时间来看发酵早期染菌可能原因有:种子带菌培养基和设备灭菌不彻底接种操作不当无菌空气带菌发酵后期染菌可能原因有:中间补料污染设备渗漏操作问题。种子带菌:一般根据种子制备过程中的无菌样和接种后剩余种子做的无菌样进行监测。根据实际情况看种子带菌多是操作带入一般为球菌。但笔者也遇到了菌种因摇瓶培养基未消透而出现染菌的情况一次为更换了一种原料其中有大量杂菌使用原工艺难以完全灭菌。一次为使用了较大摇瓶由ml摇瓶装ml改为ml摇瓶装量没了在没有进行验证的情况下使用原工艺进行灭菌结果因装量大摇瓶升温慢(灭菌柜测量的是排气口的温度而不是培养基的温度)导致摇瓶培养基染菌。需要特别注意的是若监测种子的无菌样都正常就应当立即放弃种子带菌的可能把精力转移到其他方面去寻找真正的染菌原因否则会影响原因的查找。

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