金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响

金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响 金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增 殖及凋亡的影响 2162 ? 研究原着? 第『几『:医大(JFoul'IllMilMedI1l1ivlI1ll;!!!::!: 文章编号:1000-2790(2005)23-2162-04 金雀异黄素对高糖培养下大鼠系膜细胞增殖及凋亡的影响 孙莉静.,袁伟杰,张小瑛,梅小斌,郭志勇,陈光椿,张军 (第二军医大学长海医院:..肾内科,实验诊断科,!第二军医大学病理生理学教研室, 上海200433) Effectofgenisteinonapoptosisand proliferationofratmesangialcellscul- turedinhighglucose SUNLi—Jing,YUANWei—Jie,ZHANGXiao—Ying.,MEIXiao— Bin,GUOZhi—Yong',CHENGuang—Chun,ZHANGJun 'DepartmentofNephrology, DepartmentofLaboratoryDiagnosis. ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicialUniversity, DepartmentofPathophysiology,SecondMilitaryMedicialUniver— sity.Shanghai200433.China 【Abstract】AIM:Toevaluatetheeffectofdifferentconcen- trationsofgenisteinontheproliferationandapoptosisofrat mesangialcellsculturedinvitroinhighglucose.METH- ODS:Mesangialcellsweretreatedindifferentgroups.Con— trolgroup(1owglucoselg/Lwithoutgenistein)andexperi— mentalgroups(highglucose4.5g/Lwithgenistein0,l,5, lO.30and50pmol/L)wereestablishedandincubatedfor l2.24.36and48h.Theproliferationeffectofgenisteinon cellswasmeasuredbyM1-rmethod.Agarosegelelectro- phoresisofDNAextractedfrOmdifferentgroups.thetermi- naldeoxynucleotidyltransferase—mediateddUTPnickend labeling(TUNEL)techniqueandflowcytometryusingpro- pidiumiodidestainingwereperformedtoidentorquantify theapoptosisofcells.RESULTS:Quantitativeanalysisof apoptoticcellsshowedthattheapoptoticrateoftheme— sangialcellstreatedwithgenisteinfor24hwassignificantly higher,in10,30and50pmol/Lgenisteingroupsthanthat innormalcontrolgroup(P<0.05).Nosignificantdiffer- enceofthegrowthinhibitionwasfoundin0.1and5pmol/L genisteingroups.Thecellapoptoticrateincreasedinapos- itivemannerofgenisteinconcentrationandcultureduration. CoNCLUSION:Genisteinhasanintrinsiccapabilityofin- hibitingtheproliferationandinducingtheapoptosisofme— sangialcellsinculturedhighglucoseandtheseeffectsare inagenisteinconcentrationandtimedependentmanners. 【Keywords】genistein;cellproliferation;apoptosis 收稿日期:2005-03-04:修回日期:2005-09—30 基金项目:上海市科委基金(024119095) 通讯作者:袁伟杰.Te1.13801777273Email.weijiebs@online.sh.cn 作者简介:孙莉静(1976一),女(汉族),江苏省扬州市人.硕士,医师 Te1.(021)25072070Email.sunlijing68@yahoo.coll1.cn 【摘要】目的:探讨金雀异黄素对体外高糖条件下大鼠系膜 细胞(MC)增殖及凋亡的影响.方法:对照组:低糖DMEM培 养液(不含金雀异黄素),实验组:高糖DMEM培养液(含0, 1,5,10,30,50txmol/L金雀异黄素),各组分别培养l2,24, 36,48h.氮蓝四唑盐(M1Tr)法检测MC的增殖情况,DNA琼 脂糖电泳,末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL) 法,流式细胞术3种方法检测细胞凋亡情况.结果:10,30,50 txmol/L金雀异黄素作用24h可明显诱导细胞凋亡(P< 0.05),而0,1,5~mol/L作用不显着.随着金雀异黄素浓度的 增加,凋亡比例增加;同一浓度的金雀异黄素随着作用时间的 延长,凋亡比例亦增加.结论:一定浓度的金雀异黄素在体外 高糖培养条件下,可抑制大鼠MC增殖,促进其凋亡,且与其 浓度和作用时间有关. 【关键词】金雀异黄素;细胞增殖;细胞凋亡 【中图号】R587.1【文献标识码】A 0引言 糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病 最常见和严重的并发症之一,是造成终末期肾衰的主 要病因,具体发病机制目前尚不清楚.近年发现大豆 及大豆蛋白具有加速脂质清除,抗动脉粥样硬化,抗 氧化等生物功效?,这些作用与其中所含的多酚类 混合物一大豆异黄酮密切相关.肾脏血管病变,高脂 血症和氧自由基等是DN发生和发展的重要因素,大 豆异黄酮的上述功能,暗示了它们可能对肾脏细胞具 有良好的保护作用.目前此类物质对肾脏细胞直 接影响的报道较少.肾脏系膜细胞(mesangialcell, MC)是致病因子作用的主要靶细胞.我们研究大豆 异黄酮的主要生理活性成分一金雀异黄素对高糖培 养下大鼠MC生长的影响如下. 1材料和方法 1.1材料大鼠MC株38cc水浴复苏,生长于含6O mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养液中,7d左右达 融合状态,实验采用传代的第3代MC,进入实验后 无血清(5mL/L)培养,分别在金雀异黄素作用的12, 24,36和48h终止培养.实验分为对照组:低糖无血 清DMEM培养液(葡萄糖浓度lg/L不含金雀异黄 素);实验组:高糖无血清DMEM培养液(葡萄糖浓度 第四军医大学(Jr(JIthMilMedi,)7()23I1Il:/j【}II:!::!: 4.5g/L金雀异黄素浓度为0,1,5,10,30和50 t~mol/L),空白对照组只加培养液无细胞.Genistein 购自Sigma公司(M270.2,纯度?98%),取 Genistein5mg溶于1.85mL二甲基亚砜(DMSO)中, 配成1×10mol/L母液,实验时按需要稀释成各浓 度工作液.细胞凋亡检测试剂盒购自宝灵曼公司,细 胞周期检测试剂盒购自Becton-Dickinson公司,噻唑 蓝(MrrI1)购自上海华舜生物试剂公司. 1.2方法 1.2.1MTI"法检测细胞增殖MC生长于96孑L培 养板(1×10/孔),24h后换不同浓度金雀异黄素的 无血清培养液,培养结束后每~LTJt]人MTI"液20L, 37~C,50mL/LCO继续培养4h,反应结束后每孑L再 加入DMSO150IxL,振荡至蓝紫色结晶完全溶解.将 溶解后的液体转至96孑L酶标板,在A帅处以空白对 照组调零,酶联免疫检测仪测定各孑L的吸光度(A) 值.每组设4个复孔. 1.2.2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡MC生长于 6孑L板(3×10/孑L),培养结束后2.5g/L胰酶消化, 收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞,3000 r/min常温离心6min,加人0.5mLDNA裂解液,37~C 50mL/LCO培养30min.加20g/L蛋白酶K5, 55~C水浴过夜.等体积酚,酚:氯仿(1:1),氯仿各抽 提一次,2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,5000g低温 离心15rain,750mL/L乙醇洗2遍,自然晾干,加人 pH8.0的TE400IxL摇匀,再加人10g/LRNaseA5 IxL,37~C50mL/LCO培养30min.酚:氯仿(1:1), 氯仿各抽提一次,2倍体积的无水乙醇沉淀DNA, 5000g低温离心15min,750mL/L乙醇洗2遍,自然 晾干,加人TE20L溶解,4~C保存.琼脂糖电泳检 测DNA纯度.10ILLDNA溶液与4×上样缓冲液2 L混匀后,于15g/L琼脂糖凝胶100V电压下电 泳,紫外灯下观察并摄影. 1.2.3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡MC生长 于含消毒盖玻片的6孑L板(3×10/孑L),终止培养后 按以下 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 处理细胞:40g/L多聚甲醛固定细胞30 min,PBS冲洗盖玻片,2mg/L蛋白酶K消化细胞,于 37~C,50mL/LCO培养20rain,PBS冲洗盖玻片,加 人100IxLTUNEL缓冲液,37?,50mlJLCO,培养 60min,冲洗盖玻片,加入TUNEL标志物,37~C,50 mL/LCO:培养30min,冲洗盖玻片,DAB显色10 min,蒸馏水冲洗,苏木素衬染,自来水返蓝,冷风吹 干,明胶封固,60~C烤箱烤干.显微镜下观察并照相, 阳性标记细胞核为棕染棕黄色颗粒. 1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡MC生长于6孔 板(3×10/孑L),培养结束后2.5g/L胰酶消化细胞, 收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞,3000 r/min常温离心5min,弃上清,按细胞周期试剂盒说 明书操作:加人Buffer缓冲液1mL,3000r/min常温 离心5min,弃上清,加人Buffer缓冲液1mL,3000 r/min常温离心5rain,弃上清.加人SolutionA250 L,摇匀,室温放置10min;加人SolutionB100IxL, 室温放置10min;最后加人SolutionC100IxL,4~C放 置10min,上机检测细胞周期及凋亡率.每个实验重 复3次.以CellQest软件分析细胞周期及凋亡率. 统计学处理:计量资料用4-s 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示,组间差异比 较采用方差分析,两两比较用Dunnett-t检验,使用 SPSS10.0软件进行统计分析,P<0.05时认为差异 有统计学意义. 2结果 2.1MTT法检测细胞增殖在高糖培养的早期 (48h以内),高糖可促进MC的增殖(与对照组相比 P<0.05).低浓度金雀异黄素(1t~mol/L)对细胞生 长的抑制作用不显着;高浓度的金雀异黄素(>5 ~mol/L)对细胞的抑制作用较强,作用具有时间,剂 量依赖效应(Tab1). 表1金雀异黄素作用下大鼠系膜细胞增殖状况 Tab1Proliferationofratmesangialcellsincubatedwith s) genistein(n=6,A,? 2.2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡高浓度组 10,30,50p~mol/L组作用24h,DNA琼脂糖凝胶电泳 出现特征性的由大小不同的DNA片段组成的数条梯 形条带(DNAladder);5t~mol/L组出现模糊不清的 条带;0Ixmol/L组,1t~mol/L组与对照组在离加样孑L 不远处,为大分子基因组DNA条带表现,无梯形条带 出现,意味着几乎没有细胞凋亡的发生(Fig1). 2.3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡金雀异黄 素浓度为10,30,50p~mol/L组作用24h,细胞核呈现 第四军大学:报(JFotH'tl1MilMed[!niv)2005;26(23).?1 3讨论 体外葡萄糖1g/L升至4.5g/L时对MC具有双 重作用,培养24,48h内可刺激细胞增殖,72,96h 则抑制细胞增殖,促使细胞发生肥大.我们将4.5 g/L葡萄糖作用于MC,在48h内可促进MC增殖.细 胞的凋亡与增殖平衡是组织保持一定的细胞数量,维 持正常生理功能的主要因素j.许多研究表明,细胞 凋亡是使增殖的肾小球MC数量和结构恢复正常的 重要机制.在DN的治疗过程中,有效地阻止早期 MC过度增殖及细胞外基质(ECM)的聚积,是防止肾 小球硬化的理想措施.金雀异黄素是一种天然异黄 酮类物质,具有雌激素活性作用,同时具有抗氧 化,抗炎和抗增生等特性,是酪氨酸激酶(K), DNA拓朴异构酶?和核糖体S6激酶的抑制剂,能调 控细胞周期的有丝分裂,细胞生存,细胞转化和诱导 细胞分化.我们发现,在48h内,1I.Lmol/L金雀异黄 素对细胞增殖影响不显着;高浓度的金雀异黄素(> 5I.Lmol/L)对细胞增殖具有显着的抑制作用,作用具 有时间依赖,剂量依赖关系.如果金雀异黄素促进 2l65 DN早期增殖的MC凋亡能得到进一步确证,则有可 能起到延缓早期病情进展的作用. 【参考文献】 [1]AnthonyMS.Soyandcardiovasculardisease:Cholesterollowering andbeyond[J].JNutr,2000;130(3):662—663. [2]VelasquezMT,BhathenaSJ.Dietaryphytoestrogens:Apossiblerole inrenaldiseaseprotection[J].AmJKidneyDis,2001;37(5): l056一lO68. [3]RoosA,SatoT,MaierH,eta1.Inductionofrenalcellapoptosisby antibodiesandcomplement[J].ExpNephrol,2001;9:65—70. [4]AmoreA,CoppoR.Roleofapoptosisinpathogenesisandprogres— sionofrenaldisease[J].Nephron,2000;86:99—104. [5]AnJ,TzagarakisC,ScharschmidtTC,eta1.Estrogenreceptorbeta- selectivetranscriptionalactivityandreeruitnlentofcoregulatorsb. y phytoestrogens[J].JBiolChem,2001;276(21):17808—17814. [6]WijetungeS,LymnJS,HughesAD.Effectsofproteintyrosinekinase inhibitorsonvoltage—operatedcalciumchannelcurrentsinvascular smoothnmsclecellsandpp60(c—src)kinaseactivity[J].', Pharmacol,2000;129(7):1347—1354. 编辑甄志强 ??????????????????????????????????????????????? ? 经验交流?文章编号:1000-2790(2005)23—2165-01 肾移植术后妊娠4例 陈瑞.,张寅生,张峰波.(.武警陕西省总队医院肾 移植中心,陕西西安710054,北京协和医院泌尿科,北京 100005,北京友谊医院泌尿科,北京100050) 【关键词】肾移植;妊娠 【中图号】R699.2【文献标识码】B 1病例资料本组4例患者来自我院(1994/2004)468例肾 移植术后患者,妊娠时年龄(27.5?2.3)岁,妊娠距肾移植时 间(30.2?10.5)mo,原发病3例为慢性肾小球肾炎,1例为1 型糖尿病.均为首次移植患者,供肾热缺血时间(6.0?2.1) min,冷缺血时问(8.4?1.2)h,供,受者ABO血型相容,淋巴 细胞毒性试验阴性.4例手术均采用供肾动脉与受者的髂外 动脉端侧吻合.手术顺利,术后给予"甲基强的松龙+环磷酰 胺"冲击治疗,术后2,3d肾功恢复正常,继以"环孢素A+ 霉酚酸酯+强的松"规律免疫抑制治疗,术后3,6mo月经来 潮,经期规律.术后定期随访,血压(140.2?18.0)/(84.8? 13.5)mmHg(1mmHg=0.133kPa),血肌酐(119.1?22.3) ~mol/L,尿蛋白检测阴性,Doppler超声检查该4例患者移植 收稿日期:2005-09—13;修回日期:2005—10—11 作者简介:陈瑞(1973一),男(汉族),湖南省澧县人.本科,主治医师 Te1.(029)82245120 肾皮质血流丰富,CSAC.浓度为117,193nmL.患者妊娠 期间每2wk进行常规育前检查,1例于孕20wk时出现发热, 全身乏力,尿量减少,移植肾区胀痛等不适,查血肌酐450 ~mol/L,诊断为急性排斥反应,经甲基强的松龙冲击治疗后肌 酐恢复至正常水平.4例患者妊娠期间均未发生先兆子痫,心 力衰竭,蛋白尿,急性肾盂肾炎等并发症.4名胎儿的胎龄为 (35.0?3.0)wk,均为剖宫产,3男1女,体质量(2415?60) g,身长(50?3)cm,Apgar评分均为10分.婴儿出生后均为人 工喂养,智力及发育正常,现年龄最大者8岁,最dx~-4岁. 2讨论自1958年世界上首次报道肾移植受者妊娠成功, 并娩出一活婴后,各国不断有类似报道.本组4例患者在受 孕时肾功均处于正常状态,妊娠中注意控制血压,避免肾毒性 药物的应用,减少免疫抑制剂的用量以及及时采用剖宫产术 结束妊娠,减少正常分娩过程对产妇的应激作用,使患者顺利 生产.目前,肾脏移植界对于肾移植术后有生殖能力的青年 女性妊娠问题仍处于进一步临床研究阶段,故尚未提倡;再 者,绝大多数该类患者及家属出于对移植肾与妊娠,胎儿之问 互相影响的恐惧,均主动或被动地采用了避孕措施.综上所 述结合我们的经验,我们认为对于肾移植术后20mo以上的 患者,以维持剂量应用免疫抑制剂,只要孕前一般情况良好, 肾功正常,妊娠期注意控制血压,维持肌酐于正常水平,定期 移植肾功能评价,产前各项常规检查,避免感染,急慢性排异 反应发生,以及通过剖宫产术及时结束妊娠等措施的应用是 可以使肾移植患者正常妊娠和分娩的. 编辑黄良田