单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其药效学研究（可编辑）

单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其药效学研究（可编辑） 中国海洋大学 硕士学位论文 单环刺?纤溶酶的分离纯化及其药效学研究 姓名:蒋仲青 申请学位级别:硕士 专业:海洋生物学 指导教师:刘万顺 20090601单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学研究 摘 要 血栓栓塞性疾病一直以来严重危害着人类的健康,不仅发病率高,而且死亡 率和致残率也很高,它主要危害心、脑,肺等血管系统,造成人死亡或者偏瘫残 疾。全世界每年新增万血栓性病人,在我国每年约有多万人死于心脑 血管疾病,急需溶栓治疗的病人超过万。因此,血栓性疾病药物研发己经成 为当今全世界医学界研究的重点。 应用溶栓剂进行溶栓治疗是当前治疗血栓性疾病的主要手段。虽然溶栓剂已 发展了三代,但仍有诸多的副作用,如特异性降解纤维蛋白能力 低,易诱发机体 出血等。因此,寻找和开发新型溶栓剂仍是治疗血栓性疾病的重要内容。鉴于海 洋生物活性物质自身其独特的优点,海洋生物逐渐成为新药研发的珍贵资源。本 实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺嗌蹄办括材,聆螂中寻找和分 离出了一种新型纤溶酶,命名为单环刺蜢纤溶酶,并对其酶学性质和药效 学活性展开相关研究,现将主要研究结果简述如下: 一,一 .单环刺蜢体腔液经分子量,截留超滤, 和 一柱层析分离,获得酶组分经分析其纯度为 %,.电泳图谱呈单一蛋白条带。.法测其相对分子 质量约为。酶纯化倍数为.,回收率为.%。 .对此酶进行相关酶学性质的研究,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明的最适反应温度为 ...时相对稳定;在?一 ?,最适反应为.;酶活力在 ?温度范围内,具有良好的热稳定性。孑对酶的活性有促进作用,、 ’、、”、等离子对酶活性均具有一定的抑制作用。以 酪蛋白为底物,根据双倒数作图法,求得该酶的米氏常数‰.‖ 为,最大反应速率.?咖?。 .具有直接纤溶活性和激酶活性的双重纤溶能力。以尿激酶 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品为 参照,琼脂糖纤维蛋白平板法标定的总活力效价为每酶含. 个尿激酶活力单位,其中激酶活性为每酶含.个尿激酶活力单位,约占酶总活力的.%。 .溶血性实验,皮下出血实验,全身过敏实验证实,该酶具有良好的生物 安全性。急性毒性实验验证的半致死剂量为./,% 的可信限为.?./,无毒性。 .根据降解纤维蛋白原产物分析,推测其为.纤溶酶。 . 体外溶栓实验表明,组时血栓溶解率达.%,与蚓激酶对照组 有显著性差异.,具有直接溶解纤维蛋白的能力。 . 可显著延长,,和值,具有明显的抗凝效应,但其 抗凝效应不作用于抑制血小板聚集这一环节。体内颈动脉血栓各指标实 验表明,可使时间显著缩短,纤维蛋白降解产物含量增 多,.二聚体反应呈阳性,说明使机体继发性纤溶途径明显增强, 提高了机体整体的纤溶活力。 综上所述,具有显著的抗凝活性和纤溶活性,具有重要的临床开 发 价值,值得深入研究。 关键词:单环刺蜢;纤溶酶;分离纯化;抗凝活性;溶栓活性; ‖厂 厅/“刀//,亡 , ,, 何 锄 曲甜觚 砌, , .虢舶 , 她 巩” ., 、? .锄 . , 疵也, 胁 伊, . , . 】 , , 舶 . 舶 ,陀如西“,加螂. 锄锄 印, 巧 . 陀办括 . 万 甜门加,螂, 删 .一.? .订 , . ?.砣办括“,纪砌,螂 .? ... ?. 矿,、”、、、、. ,锄 “ : . “‖., ./..丘仃砷 . 够.. /,廿.%. /, . 徊 ,画 丘啪?够 够./,%, .?. 眺,. ., . 缸 , ..%世嘶 舶血, , 伊 印 虢. . .,, ,’鲥锄枷彘, ,. 工?.】.曲 靠 了. 】. 肺” 吼 . :【施厅扭口以记跏姗;巧; ; 够; 够缩略语 抛办括肌纪刀如谬活化部分凝血活酶时间 甜 凝血酶原时间 凝血酶时间 纤维蛋白原纤维蛋白降解产物 黟优球蛋白溶解时间 . 组织型纤溶酶酶原激活剂 , 弥散性血管内凝血纤维蛋白稳定因子. 尿型纤溶酶原激活剂 锄 纤溶酶原激活物抑制剂 面 .单链纤溶酶原激活剂 . 够灿 凝血酶可激活的纤溶抑制物 .龇舶 .肝素辅因子 印撕 .组织因子途经抑制剂 砒 ? 冲 富血小板血浆 贫血小板血浆独创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含其他教育机构的学位或证书使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社会公 众提供信息服务。保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师擗五’万,恢 签字眺必办目 一期叫年呷日单环刺蜷纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 第一章 前言 血栓性疾病概述 .血栓疾病类型 血栓生疾病一直以来严重危害着人类的健康,不仅发病率高,而且死亡率和致 残率亦高,发病率居首位的为心、脑血管血栓性栓塞,深静脉血栓以及肺栓塞的并 发症等 .,。随着人口年龄的老化,血栓性疾病发生率也相应提高。 据估计,全世界每年患有血栓性疾病约万人乐忠庆,,而其中每年死于 心脑血栓疾病的就高达万人屈晨雪,。在我国,血栓性疾病造成的损失 也极为严重。在我国每年约有万人需要溶栓治疗,每年约有多万人因此死 亡任乐民,。因此,血栓性疾病药物的研发己成为医学界研究的一个重点。 根据血栓产生的部位,可将血栓疾病划分为动脉血栓疾病和静脉 血栓疾病。 动脉血栓疾病的血栓大多形成在动脉粥样斑块破裂和血管内皮细胞受损处,粥 样破裂的斑块和内皮下的胶原纤维与血液中的成分相接触,凝血过程被启动,最终形 成血栓,造成组织缺氧性损伤直至坏死。动脉血栓形成在不同的器官会诱发各种不同 疾病。脑动脉硬化是由于颅内血凝系统失调引发脑部血流障碍,造成脑缺血、缺氧 而发生的一种缺血性或出血性脑血管疾病,最容易发生在脑部的大、中动脉的狭窄 部位、椎动脉进入颅腔处、以及基底动脉起始和分叉处马建波,。在心脏血 管处出现的因纤溶功能不足而产生的动脉粥样硬化斑块是冠心病诱发的原因。王晓 琴,, ..,。据不完全统计,我国冠心病发病率为.%,全 国有近八千万患者,每年死于各种冠心病的人数保守估计超过万,死于其并发症 的人数则估计超过万。而针对脑血栓疾病的统计中,急性脑卒中风的发病率男 性为卜/万人,女性为?/万人,至年底,由动脉粥样血栓导 致的死亡人数占人群总死亡的.%。 静脉血栓形成 是静脉的一种急性非化脓性炎症,并伴有 继发性血管腔内血栓形成的疾病。病变主要累及四肢浅表静脉或下肢深静脉。其临 床特点为患肢局部肿痛、皮下可见条索状物或伴有病变远端浅表静脉曲张等现象。 偶可因血栓脱落而造成肺栓塞,危及患者生命。本病在年龄和性别上无特异性。手单环刺蟠纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 术后并发上肢静脉血栓形成的发病率为.%,下肢静脉血栓形成.%,上腔静 脉血栓形成.%,下腔静脉血栓形成.%。其中并发肺栓塞%。 静脉血栓形成的病因主要为静脉壁损伤和静脉血流缓慢。静脉壁损伤主要发生 在静脉入口的薄弱管壁处,薄弱的管壁内膜上若发生微小的裂伤便可使得血小板发 生粘附,出现纤维蛋白沉积。静脉血流缓慢多起因于长期重病卧床,晚期癌症或【卜 抗胰蛋白酶的含量增高等。静脉血栓形成因发病部位不同,有浅部静脉血栓和深部 静脉血栓形成之分,浅部血栓静脉形成以静脉行径出现红色结节或条索状硬块、局 部肿痛及压痛为主要症状,多发于四肢穿刺静脉。相比之下,深部静脉血栓形成最 为常见,其危害性也最大。以大块肺栓塞表现成为第一症状,伴有小腿静脉或胭静 脉内炎症,局部疼痛,行走时痛感加重李家增,。据统计,美国每年至少有 万深部静脉血栓的患者,其中有万人并发肺血栓栓塞。此外,静脉血栓的发 生率要比动脉血栓高倍。 .血栓的形成机制 正常血管内膜与循环血流中的各种血液因子处于互不“反应”的平衡状态。血 管内膜的损伤时可使局部血流紊乱,导致凝血因子被活化,从而启动了血栓形成反 应过程。有关血栓形成的基本条件及机制,德国病理学家在年时就已 经做过较为详细的阐述,他认为血栓的形成主要取决于三个因素?血管壁损伤?血 流改变?血液成分异常,这三个基本要素决定了血栓形成的部位、血栓成分以及血 栓体积的大小。此外,由于动静脉血管壁结构差异,所处的血液动力学状态不同, 使得动静脉血栓形成机制的侧重点有所不同,如动脉血栓的主要启动因素是动脉血 管壁结构损伤所致;而静脉血栓形成的始发因素多以血液成分中的某些因子的变化 为主。此外,静脉血栓与动脉血栓的成分构成也有所不同,静脉血栓富含纤维蛋白 和红细胞,动脉血栓主要由较为稳定的纤维蛋白和血小板组成。 .凝血与纤溶的基本原理 在正常生理状态下,人体血液中存在的凝血系统、抗凝系统及纤溶系统处于动 态平衡之中,以保证血液在血管内循环流动,维持体内各器官的正常功能。 单环刺蝣纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ..凝血系统 血管受到损伤后,通过自身的凝血系统发挥凝血作用可以产生凝血现象,防止 血液流失,其化学本质是将溶胶状态纤维蛋白原,转化为凝胶状 态的纤维蛋白。、和于年分别提出了凝 血过程的瀑布学说,他们认为多种凝血因子的活化是导致血液凝固的触发机制,这 是一个逐级激活过程,且每一步反应均有放大效应,而参与此反应最主要的是凝血 酶的活化,其非活性形式的前体为凝血酶原。 凝血过程图卜的触发机制不同,主要分为内源性凝血和外源 性凝血。内源性凝血是指血管内膜受损或血液抽出体外接触异物表面而 触发的仅有血管内凝血因子参与的凝血过程,常见于感染、内毒素血症、持续缺血 缺氧引起酸中毒或颗粒与胶体物质进入血液循环等;外源性凝血是指有受损组织释 放的组织因子 ,所参与的凝血过程,严重创伤和烧伤、外科手术、 产科意外、病变器官组织的大量坏死、癌组织坏死均可诱发此途径。内外源两个通 路最后都是通过激活凝血因子和,并在磷脂胶粒、桥连作用下,水 解凝血酶原为凝血酶图卜,使纤维蛋白原凝集为纤维蛋白,。 在某些病理情况下,也存在其它凝血激活途径,如:?单核巨噬细胞和白细胞 激活时也可表达因子参与反应?某些恶性肿瘤细胞不但能表达,而且能分泌 特有的癌促凝物质 ,和某种粘蛋白,可直接激活因子? 患有出血性胰腺炎或胰体、胰尾部出现恶性实质性肿瘤时,会产生大量胰蛋白酶使 凝血酶原被直接激活?机体出现大量溶血时,红细胞所释放的可诱导血小板出 现凝集现象。 单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ; ; . /?、 ×玎: × ../?、 工 ×工 ,,,?、 工 ? 卜幽一弧?~?;,? × 二 /弋、 茎璺 ; 时吖 【 /~、 ’. 。,,‘ ’\ /’ ; , 日它 ‘,?:?’?/ .、\/ /一一 , 一,‖一,一?、、 .’ ’蠢, ‘ ? 。;图.凝血过程的逐级反应 .? 合俸 ?。 凝盘爵 。。【 图.凝血酶形成反应 咖.? 凝血反应中,另一个关键的反应物质为纤维蛋白原分子,它是由 两对【链、 链及丫链组成,每条肽链、、绞合成索状,形成两条索状肽链,在末端的 二硫键起稳定作用。其结构见图.。 单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 。.?洳 证笮曲靛副缮亡蟮对拜班势 。、 :妻篡篡竺:兰登型鎏盥兹啦妇.,、 拣妇硝勰 ‘’ 图一纤维蛋白原结构示意图.? 活化的凝血酶作用于纤维蛋白原【和链上的精一甘肽键,切除、纤维 上带较多负电荷的酸性肽段,从而消除了电荷排斥作用,暴露出互补结合位点, 在纤维蛋白稳定因子研 ,?和参与下,纤维蛋白单体 的丫链谷氨酸羧基与【链的赖氨酸的氨基之间形成共价结合,形成稳定的网状纤维 蛋白多聚体一 嘶,其包裹着血小板、红细胞、白细胞和血浆,即形 成凝固的血浆或血栓。 ..抗凝系统 凝血过程是一个级联放大的瀑布效应,最初生成的酶活性在正反 馈作用下得到 了极大增强,可达原来水平的增强倍。如此高的激活速度一旦启动,全身的血 液就会凝固,但人正常的生理性凝血仅限于受损局部,这意味着机体自身必然存在 着与凝血系统相对立的抗凝系统来与之保持动态平衡。 体内抗凝调节机制大致分为两个方面:细胞抗凝与体液抗凝。 细胞抗凝是指单核巨噬细胞系统对激活的凝血因子、组织因子、凝血酶原复合 物及可溶性纤维蛋白单体的吞噬作用。与细胞抗凝机制相比,体液抗凝具有快速高 效等特点,其组成主要包括?丝氨酸蛋白酶抑制物,对激活的凝血因子有灭活作用, 如抗凝血蛋白,抗凝血酶是一种分子量约,的糖蛋白,在肝素 配合作用下,在能与凝血因子 、、、?、?以:分子比结合形成复 合物,从而封闭凝血酶的活性中心。?蛋白质系统,凝血酶与凝血酶调节蛋白结 合,激活蛋白为活化蛋白 ,,在辅因子蛋白的协同 下,可降解因子和?。?组织因子途经抑制剂 ,,由内皮细胞产生,可抑制因子对凝血过程的启动。 单环刺蛇纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ..纤溶系统 体内凝血系统和纤溶系统是相互依存紧密相联的,机体一旦产生凝血反应,也 几乎同时激活了纤溶系统,将体内多余的血栓移除,并通过“负反馈效应”降低体 内纤维蛋白原水平,从而避免纤维蛋白的过多凝聚。 纤溶系统由纤维蛋白溶解酶原、纤维蛋白溶解酶、纤溶 酶原激活剂 和纤溶酶原激活物抑制剂 种成分组成。整个纤溶过程可分为两个部分,即纤溶酶原的激活和纤维 蛋白或纤维蛋白原的降解。 ...纤溶酶原 在人的血管系统中,纤溶酶原是由脾、肾和嗜酸性粒细胞等组织合成的一种单 ,血 链糖蛋白,含个氨基酸残基的肽链,末端为谷氨酸。分子量为, 浆中存在浓度为.?. /,半衰期 ,其只有被纤溶酶原激活物激活 为纤溶酶后,才具有降解纤维蛋白的作用。 纤溶酶原的激活是降解纤维蛋白的关键步骤。纤溶酶原在纤溶酶原激活物的作 用下被裂解成双链且自身构象发生变化,转化为谷氨酸纤溶酶。生成的谷氨酸纤溶 酶又可以裂解纤溶酶原端的几处肽键,生成分子量略小的几种纤溶酶原。这些小 分子的纤溶酶原更容易被纤溶酶原激活剂活化为小分子纤溶酶。小分子纤溶酶对纤 维蛋白的亲和力可增加倍,这不仅是增强纤溶过程的一种有效的正反馈机制,而 且还可以将纤溶过程限制在纤维蛋白产生的部位,提高了纤维蛋白降解的特异性, 降低了诱发机体出血的几率。 纤溶酶原的激活途径分为三种,即内源性激活、外源性激活和外部激活。内源性 激活是指由血液中存在的活化因子激活纤溶酶原为纤溶酶的过程,上述因子多来自 静脉或微静脉的内皮细胞,其活性在上肢静脉较之下肢静脉高,这也是下肢静脉血 栓比上肢静脉多的原因之一;外源性激活是指由血管内皮细胞和肾脏等组织产生的 激活因子而实现的,此类激活因子在子宫、卵巢、肾脏及肺组织中含量尤其丰富, 恶性肿瘤初期和胎儿发育期的分化细胞,也能释放大量活化因子戚正式,。外 部激活是指通过体外给药途径将纤溶酶原激活为纤溶酶的过程。 目前应用于临床研 究和治疗的注射用尿激酶,蚓激酶和纳豆激酶等药物都是通过外部激活来实现纤溶 疗效的。 单环刺蟠纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ...纤溶酶 激活后的纤溶酶是一种具有纤维蛋白溶解活性的双链丝氨酸蛋白水解酶,其作 用机制是选择性裂解纤维蛋白和纤维蛋白原肽链中.玛之间的肽键,使两者被 分割成许多可溶性的小肽,这些小肽类物质均具有一定的抗凝作用。纤溶酶还可以 分解凝血因子、?、?、?、?等物质,减弱机体的凝血倾向。纤溶酶自身活性 受激活剂和抑制剂的调节。 ...纤溶酶原激活剂 ,?和尿型 组织型纤溶酶原激活剂纤溶酶原激活剂 ,?是人体内主要的两种 锄 纤溶酶原激活剂。?是一种糖蛋白类丝氨酸蛋白酶,由血管内皮细胞合成,分子 量为, ,血浆半衰期为左右。当机体内有纤维蛋白存在时,?与 纤维蛋白和纤溶酶原形成三者复合物,激活纤溶酶原为纤溶酶进行血栓降解,保持 血流畅通李鑫,。?最初是从人尿中纯化出来的一种丝氨酸蛋白酶,因此 又称为尿激酶,,但随后在血浆、血管内皮细胞、巨噬细胞、肾细胞 等处也所发现 .,。?在血浆中以单链形式存在,并且含 量极低,一般不超过/。?除激活纤溶酶原外,还可对细胞外基质进行降 解,促进细胞的移动,有利于损伤组织的修复。此外,?和?也有一些共性 .,,即它们是氨基酸序列相似的丝氨酸蛋白酶,都能水解纤溶酶原 一之间的肽键。 ...纤溶酶原激活物抑制剂 纤溶酶原激活物抑制剂 ,主要包括纤溶酶原激 活物抑制剂一.、纤溶酶原激活物抑制剂一.、蛋白酶连接酶抑制素 以及蛋白酶抑制物。?是血浆中主要的纤溶酶原激活抑制剂,由个氨基 酸残基组成,分子量为, 。主要来源于血管内皮细胞、血小板、巨核细胞、 平滑肌细胞和肝细胞,其与?和?形成复合物而使两者失活。一还通过 .,: 抑制肿瘤细胞凋亡而促进肿瘤细胞生长尹艳茹,; ,。工一最早在子宫内被发现,是?的抑制剂,常态下在血浆中很难检测到,但孕妇血浆中浓度极高 .,; .,。此外,正 常血浆中还含有纤溶酶抑制物,又称抗纤溶酶。抗纤溶酶有两种:?单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 慢作用的抗纤溶酶,如一抗胰蛋白酶【.聊,,分子量为,,, 可与纤溶酶形成牢固的复合物。?快作用的抗纤溶酶,如。【.抗纤溶酶 .,【一,分子量,,它对纤溶酶有很强的亲合力,能瞬时形成 复合物而使其失活。此外血浆中的【.巨球蛋白【.,和 抑制物在一定程度上也能抑制纤溶酶,但它们仅在过量纤溶酶而一又不足的情 况下才发挥作用。 ..凝血系统和纤溶系统的关系 在纤维蛋白形成早期,机体凝血系统协调各种凝血因子参与反应,形成的凝血 酶使纤维蛋白原凝集交联为网状结构的纤维蛋白聚合体,纤维蛋白是纤溶系统中关 键因子纤溶酶的底物,其含量的多少直接调控着纤溶系统的启 动。伴随着凝血系统 的启动,凝血过程中生成的过多纤维蛋白打破了两系统间动态的平衡,此时的机体 逐渐由凝血向纤溶转化。纤维蛋白通过结合?加速了纤溶酶原转变为纤溶酶的进 程,而纤溶酶的不断生成进一步灭活了参与凝血反应的等因子,使得机体的凝血 效应继续减弱,由此产生了纤溶抑制凝血的反馈作用。等机体多余的纤维蛋白降解 完全后,血浆中的抗纤溶酶发挥作用降解掉多余的纤溶酶,系统又恢复正常的血液 循环。因此可见,机体内血液凝固与抗凝、纤溶与抗纤溶是相互抑制、相互协调、 共同维护血液系统的正常生理功能。图卜,卜为纤溶系统和凝血系统的联系和比 较。 凝斑 蓖血促进奸络 笠 野藩抑锐夏直 ........一 奸 奸洛酶灭活凝威日子 纤维蛋白均激活纤溶爵蕨 凝血酶?】 抑镧凝血酶 飞 。 圈 图.纤溶系统和凝血系统的联系 . ” 单环刺蟠纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ???’ 凝血 纤溶 ’???????一 纤溶酶曝一臂 肝一凝血酶象 蠹罢葚蓁萎激活物一 外薄性系统/?~。 。 激活物抑翻剂?,卜激活钧:飒来: 撬血醴 纤瞎醇 幽 拈抗怍工 产铀 纤维耋凸 篓鬟瑚解 纤维崔白原?????二.一 图.纤溶系统和凝血系统的比较. 撕 翻 .血栓疾病的治疗 在治疗早期人们发现了几种抗栓或溶栓药物,主要有肝素、香豆素类和抗凝血 酶.等,但这些药物均有一些缺陷,如疗效低、副作用大等。目前对血栓的治疗 方法有很多,如药物溶栓法、经皮腔内血管成形术、颅内动脉支架植入术、血 管内血栓切除术以及目前正在进行临床试验的血栓机械粉碎术、强化溶栓术先将血 栓粉碎,再给予溶栓药等。近些年来,又开发出介入式超声消融血栓疗法,新型旋 切抽吸系统,非介入式超声结合药物治疗等新型治疗血栓的方法高不郎,。 。溶栓药剂的应用现状及前景 ..溶栓药物 主要是利用溶栓剂将纤溶酶原激活为纤溶酶,依赖纤溶酶降解纤维蛋白或药物 本身的纤溶能力直接降解纤维蛋白。根据溶栓剂研发的先后顺序和作用机理分类, 可将溶栓药物分为一、二、三代制剂。 ...第一代溶栓剂 第一代溶栓剂的主要是以链激酶,和尿激酶, 为代表。从.溶血性链球菌培养液中提取出的一种非酶性单链蛋白质,相对分 子量为,,现在可以通过重组技术在大肠杆菌 .,。是从人尿或肾细胞组织培养液中提出的一种丝氨 中进行生产 酸蛋自酶,相对分子量为,., .,。临床实验表明, 高分子量尿激酶比低分子量尿激酶更为有效 .,。 和都是通过激活纤溶酶原,,使转化为纤溶酶单环刺蜷纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ,而溶解血栓纤维蛋白的,其优点是价廉,疗效迅速,无抗原性,可连续 用药等,缺点是无纤维蛋白特异性,副作用大,易诱发全身性纤维蛋白溶解,造成 ,; 机体出血,严重时可引发全身过敏性休克。郑思光等,;心 孙利丽等,。为了克服上述缺点,人们已经研发出重组型和,用于临 床研究王鸿利,。 ...第二代溶栓剂 第二代溶栓药物以组织型纤溶酶原激活剂.为典型代表,包括尿 激酶原、 阿尼普酶甲氧笨甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物,、吸血蝙蝠唾液纤溶 酶原激活剂.,等。此类药物具有一定的溶栓特异性,但半衰期较短, 临床应用时需大剂量?使用。连续滴注易诱发出血并发症 .,。 ’?主要是由血管 组织型纤溶酶原激活剂够 内皮细胞合成,存在单链和双链两种形式,分子量为, ., ,,可利用基因工程技术大量生产 .,; .,。? 与纤维蛋白的亲和力很高,溶栓速度快,冠脉开通率为%左右,但其易被肝脏清 除,半衰期短,用药剂量大、价格昂贵。当剂量超过时,可因导致血小板凝 集而诱发再栓塞、颅内出血等并发症张辉等,。尿激酶原?,又称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 ,,是由个氨基酸残基组成的单链糖蛋白,分子量 .,。 为, ,在天然中含量极少,主要是通过基因工程获得 .本身在无凝血块时为钝化状态,而在血凝块处.可选择性激活与纤维 蛋白结合的纤溶酶原变成纤溶酶,其本身又可被转化为双链尿激酶参与溶栓反应, 从而极大地增强.的纤溶效果。本品纤维蛋白的特异性显著优于尿激酶,且 出血副作用小。 阿尼普酶,,甲氧 笨甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物是无活性的纤溶酶原与链激酶的衍生物,分子 量为, 。通过甲酰化将纤溶酶原.链激酶复合物中纤溶酶原活性中 心可逆性封闭,以无活性形式进入体内血液循环,当复合物中纤溶酶原与血栓中纤 维蛋白结合时,引发脱甲酰化反应,使激活纤溶酶原,从而在血栓部位发挥溶 单环刺缢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 栓作用。其优点是半衰期长,约为.,可一次性静脉注射溶栓,缺点是特 .,;张辉等, 异性不高,具有抗原性,不良反应与等剂量相等 ;邹和昌,。 吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂.,从吸血蝙蝠唾液中分离得到的 种蛋白质 【和以,与人.约有%同源性,显示 出极低的免疫原性,并具有更高的纤维蛋白特异性。与?相比,用药量显著减少, 适合静脉推注,目前正在临床试验中 , ,。 ...第三代溶栓剂 随着基因工程技术和蛋白质工程技术的不断成熟发展,针对一代、二代溶栓药 物的弊端进行改造而相继研发出第三代溶栓药剂。此类药的优点可使其滴注的速度 更快,专一性更强,在半衰期及溶栓效果方面均有较大的提高。第三代溶栓剂主要 包括突变体、嵌合体及导向溶栓剂大类。 突变体溶栓剂主要针对野生型.分子的区、区、区、 区以及单独在一条链上的酶活性中心的不同功能区进行改造而获得的 .,。目前研究的较为成熟的有瑞替普酶印、替尼普酶、 兰替普酶、孟替普酶等。 嵌合体溶栓剂是选择性地将纤溶酶原激活剂的不同功能区通过偶联方式进行优 化组合来提高其特异性、减少副作用,是新型溶栓剂研究的热门领域之一。迄今报 道的嵌合体溶栓剂种类较多,研究最为成熟的为撕公司开发嵌合体, 目前正处于期临床试验阶段 ..,。 导向性溶栓剂是利用化学偶联法、基因重组技术,体细胞融合技术,淋巴细胞 杂交瘤及单克隆抗体等技术,把对血块有特异性的单抗与?等溶栓剂联结而获得 的高特异性、高溶栓效率的新型溶栓剂。目前应用较多的为导向溶栓剂和脂质体导 向溶栓剂王佃亮,。 ..抗血小板药物 血栓素 ,?心主要存在于血小板中,是一种血小板凝 集诱导剂,前列环素,主要来源于血管内皮中,是一种血小板 凝集抑制剂。以血小板凝集诱导的动脉血栓的形成,主要取决于参与反应和单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 因子的调控和它们之间的动态平衡。目前研发的抗血小板药物的药理作用基础 基于此,如抗血小板药物阿司匹林血,、苯磺唑酮、布洛芬等均是 合成调控酶.环氧酶的抑制剂,而氯吡格雷,波立维则是直接 合成酶抑制剂。 ..抗凝药物 抗凝药是针对血栓形成过程中凝血因子活化这一发病环节所设计的,对血栓的 治疗和预防显示了其独特的临床效应。经典的和临床常用的抗凝 药为口服抗凝药和 注射用抗凝药,分别以华法林和肝素为代表,还有从天然生物提取的水蛭素。 .,是临床使用最广泛的 华法林乔人立等,; 一种双香豆素类药,抑制所有需要维生素参与合成的凝血因子、?、?、 活化,使之保持无活性状态。 最早发现的天然抗凝血物质是肝素丘 ,,迄今在临床上己得到广泛使用 .,; .,; .,。 低分子量肝素 印,由普通肝素解聚而成,是一 种糖胺聚糖,其抗因子活性强,半衰期长,达峰值所需时间短。在纤溶作用和 增强血管内皮细胞的抗栓作用时更为安全叶杰等,;,;., ,近年来己渐渐取代普通肝素成为临床应用和研究的热点。 年砌首先从水蛭唾液腺中分离出了水蛭素或个氨基酸残 基,发现具有抑制凝血酶的功能赵静等,,并可进入血凝块与被束缚的凝 血酶发挥作用,能避免被宿主因子所中和,在某些方面优于肝素。 ..前景与展望 理想的溶栓药物应该是高效、无毒、快速的再通性、特异性强、 无抗原性、给 药方便、价格合理等见表.。近年来虽然随着分子生物学技术的发展以及药物 筛选手段的提高,溶栓药物的研究取得了很大的进展,但是距离理想的溶栓药物仍 有一定的距离。己经开发的第二,三代溶栓药物大多数还处在临床试验阶段,依然 存在不同程度的问题,比如.及其突变体虽疗效较好,但价格昂贵;其它来源的 纤溶酶原激活剂虽价格较低,但大多数都是非人源的,抗原性较强。所以运用分子 生物学技术和基因程技术,将现有溶栓剂优点集合起来,设计出高临床应用性的 单环刺蟠纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 溶栓药物将是国内外医药界的研究热点。同时,积极寻找研发新型天然溶栓酶,探 索建立新型溶栓剂结构仍将是未来研究的主要方向。 表.理想溶栓药物特征 ’ 蜘 理想溶栓药物特征快速的再通性静脉用药纤维蛋白特异性系统性出血发生率极低对纤溶酶原活化剂抑制物的耐受性强再梗死率低 对血压无影响无抗原性合理的价格 单环刺蜢的相关研究 单环刺蜢办括“玎俗称海肠子,为真体腔原口动物,分布于俄罗斯、 .,;李诺等,;王玮等,, 日本、朝鲜和我国的黄渤海沿岸鲫 是近年来逐渐被人们关注并了解的经济类海生无脊椎动物。由于其分类地位独特, 且能耐受高浓度硫化物,所以一直以来也是学术界研究的热点之一。 .单环刺蜢分类 单环刺蜢在分类上隶属蜢虫动物门,蝣纲,无管蝣 目,刺蜢科,刺蜢属,是无管缢目在中国沿海 分布的唯一种类王玮等,;李凤鲁等,。在分类上,蜢虫曾一度隶属于 环节动物门,后来由于蜢虫在形态解剖与生理特征等方面与环节动物相差较大而独 的核苷酸序列与环 立出来,成为单独的蜢虫动物门。研究表明,单环刺蜢 节动物具有明显不同,从而在分子水平上为蜢虫独立出来提供了部分依据 芒,, 。单环刺蟠纤溶酶白句分离纯化及药教学廿勺研宄 形态解剖 单环刺蜢介于软体和环节动物之间图一。虫体紫红色,体粗大,吻圆锥形, 长约一,宽约删一。体表满布大小不等的粒状突起,腹刚毛 对,粗大。肛门周围有一囤一根尾刚毛。体壁为皮肤肌肉囊,体腔发达,腔内 充满体腔液。体腔内无血管系统,仅有大量圆形、褐色的体腔球血球。其消化系 统出口、咽、食管、嗦囊、砂囊、胃、肠及肛门组成图卜?。 圈单环刺嗌解剖图 剐 【施?纰船甜 嘻 咖 整体,内部器官;呼吸肠前端,显示固肠肌的固着方式;,舡门囊;&纤毛沟:?, 副肠;。嗦囊;,固肠肌;,砂囊;,肠:,间质肌;,腹神经索;.肾管;,食管; 用;嘻呼吸肠;,胃:】,螺旋体;,悬浮肌 营养成分分析 %,总 单环刺蜢蛋白质含量为 %,腊肪含量为.%,总糖古量为 蛋白质含量占体重 %,比鲈鱼 %、鳝鱼 %、沙丁鱼 %及带 鱼 %的总蚩白质含量比例都要高李诺等,。 从无机元素组成看,、古量较高.其次为、、,而含量较低,杨 梓文菩,。这种高钾低钠的元素结构有助于维持人体正常的酸碱平衡,预防 和治疗高血压等病症。此外,其体壁也含有丰富的、和。 从氪基酸测定结果看,单环刺蜢含】种氨基酸色氨酸末测,涵盖了人体所需单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 的各种必需氨基酸。其体壁和消化道中氨基酸含量分别为.%和.%,其中必 需氨基酸含量分别为.%和 .%,分别占总氨基酸的.%和.%杨桂文 等,。种鲜味氨基酸,,心,,含量都比较高李诺等,; 缪辉南,。支链氨基酸和芳香族氨基酸的比值为.,其营养组成模式与人体需 要模式接近,营养价值很高。 .体内活性物质 ., 等人最早从单环刺蜢体内提取的生物活性物质是来自腹 神经索的两种新型神经肽,即蜢速激肽出咄内 和蝣速激肽 。哺乳动物速激肽为神经递质,在中枢神经系统和周围神经系 统中具有控制疼痛和情绪等作用,并在周围组织中发挥舒缓血管、分泌唾液和促进 胃肠道收缩等生物学功能。近年来、等人又从单环刺蜢中发现了 蜢速激肽 和蜢速激肽的种类似肽 .,,,它们都是无脊椎动物速激肽, 被命名为蜢速激肽?一?。【等人姑甜口,.,从单环刺蜢体壁中提取出了 具有一半乳糖苷识别活性的血凝集素,该血凝集素由三种蛋白质组成,. 、 电泳显示各组分分子量分别为 、。此外,早期还曾有人 锄 .,从单环刺蜢体壁肌肉收缩蛋白中分离出了腺苷三磷酸酶 ,。 .硫化物耐受机制 张志峰等人 .,对单环刺蜢的硫化物耐受机制进行了研究,发现 由体壁粘液细胞分泌的体表粘液层对单环刺蜢的存活非常重要,并且认为在单环刺 蜢中,部分可能被作为能量吸收和氧化,因为在单环刺蜢体壁细胞中发现了大 量与硫化物氧化有关的细胞器,这些细胞器可通过氧化硫化物来合成。鲫等 人研究了在不同浓度的硫化物环境中,单环刺蜢的体腔液细胞在其硫化物耐受机制 .,。马卓君等人发现蜢虫的血红蛋白类似于哺乳动物 中具有重要作用印 .?. 是四聚体,但其各单体间只有因少量氨基酸替换而产生的微小差异,在 间无波尔效应,与氧的亲合力不受氧含量的影响。因此说明其血红蛋白的功能更偏 向于储氧而不是携氧。这一特性使得单环刺蜢的血红蛋白可以在低潮或者水中溶氧 量迅速降低时,仍能以较高的效率与氧结合以供自身需要马卓君,。 单环刺缢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 .未来展望 单环刺蜢因其肉质鲜美和富含丰富的营养价值越来越受到人们的关注,一直以 来,其来源主要靠人工海底掘地采捕。随着人们的不断关注与认可,对其进行产业 化人工养殖势在必行。目前,我国部分沿海地区己展开了对其人工育苗的尝试。 目前,单环刺嗌主要用于供人食用,其科学研究利用价值还有待于人们的进一 步研究探讨。国外早在年代就开始了蜢虫抗毒机理、耐硫机制以及近海生态环境 保护等方面的研究,但国内相关方面的研究甚少。展望未来,随着 现代分子生物学 技术,生物下游工程等技术的不断发展,单环刺蜢的研究利用价值会逐一被发掘出 来,其体内重要的生物活性物质用途将会被逐一探明。 立论依据与意义 随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄 取极易导致血栓性疾病的发生。据不完全统计,每年所需溶栓药物的潜在市场约 亿美元邹和昌,。迄今为止,溶栓药物虽已发展了三代,大幅度降低了血 栓栓塞性疾病的致死率和致残率,但现有药物并不理想,临床用药时仍伴有副作用的发生 .,; ,;余绍玲等,: .,。因此,继续寻找研发更为有效、安全、价廉的新型溶栓剂仍是未 来溶栓研究主要方向。 自然界中存在着许多具有抗凝或者溶栓效应的天然活性物质,这些物质因其独 特的生物结构和与人近似的同源性等特点,在实际临床研究有着巨大的开发前景。 蚓激酶,纳豆激酶,蛇毒纤溶酶等具有溶栓抗凝活性的天然活性物质的相继研发, 为治疗血栓疾病带来了新的动力。与陆地生物天然产物相比,海洋生物天然活性物 质更具独特优势,无论在蛋白质结构,还是在新陈代谢产物和适应机制等许多方面 都表现出极大的研发潜力。一些从海洋真菌中提取的抗感染药物头孢霉素 血,来源于海绵的抗肿瘤药物阿糖胞苷,舡和抗病毒药物 阿糖腺昔,,来源于芋螺的镇痛药芋螺毒素,等都已 经投入临床治疗。 ,;焦炳华,;宋志刚等,。目前, 全球尚有余种海洋新药批准进入临床实验阶段许实波,:李春生,;易 单环刺缢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 杨华,。 基于以上分析,本研究希望以丰富的海洋生物资源单环刺嗌为研究对象,寻找 和提取出新型海洋抗凝溶栓活性物质,对分离提取得到的活性物质进行理化性质, 生物安全性和基础药效学的研究,探索其潜在的应用研发价值,为血栓疾病的治疗 提供新的思路。单环刺嗌纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 第二章的分离纯化 .前言 本章主要以单环刺蜢体腔液为原材料,通过离心分离、超滤、透 析、凝胶过滤 层析和离子交换层析、冷冻干燥等下游生化分离制备技术,制得 单一成分的酶组分。 经分析其纯度达到%色谱纯,?测其分子量约为.。命名为单 环刺蜢纤溶酶。 .材料,试剂和仪器 ..材料 单环刺蜢,购于青岛市小港水产品批发市场,用新鲜的灭菌海水 在容器中暂养, 使其排净动物体内的杂物。 ..试剂 试剂名称 生产厂家 分装 “三羟甲基氨基甲烷 济南试剂总厂 天津市天茂化学试剂厂 考马斯亮蓝. 济南爱博经贸有限公司 牛血清白蛋白 北京拜尔迪生物公司 %乙醇 山东济南全福无水酒精厂 %磷酸 青岛化学试剂厂 酪氨酸 中国医药上海化学试剂有限公司 酪蛋白 美国公司 五水合硫酸铜 国药集团化学试剂有限公司 柠檬酸 上海市化学试剂总厂试剂一厂 碳酸钠 北京化工厂 钨酸钠 上海试剂二厂 钼酸钠 上海市化学试剂公司 硫酸锂 上海山海工学团实验二厂单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效 学的研究 溴水 天津云大化工厂 甘氨酸 丸分装 冰醋酸 中国医药集团上海化学试剂公司 甲醇 国药集团化学试剂有限公司 考马斯亮蓝 中国医药集团上海化学试剂公司 丙烯酰胺 上海生工进口分装 双丙烯酰胺 上海生工进口分装 加分装 十二烷基硫酸钠 上海生工进口分装 过硫酸铵 上海生工 一巯基乙醇 舳分装 甘油 上海生工 上海生工 溴酚兰 甘氨酸 瑚分装 冰醋酸 中国医药集团上海化学试剂公司 甲醇 国药集团化学试剂有限公司 考马斯亮蓝. 中国医药集团上海化学试剂公司 加分装 低分子量标准蛋白.一 ..主要仪器 一高速冷冻离心机 上海湘仪离心机仪器有限公司 超滤系统 美国公司 北京普析通用仪器有限公司 一自动分光光度计 美国公司 , 北京博医康实验仪器有限公司 一冷冻干燥机 .型层析实验冷柜 北京博医康实验仪器有限公司 ?全自动液相分离层析仪 上海沪西分析仪器厂 循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 上海安亭电子仪器厂 磁力搅拌器 超纯水器 北京长风仪器仪表公司 .型制冰机 日本公司 美国公司 计 .台式离心机 上海安亭科学仪器厂单环刺蜢纤溶酶的分离纯化 及其药效学的研究 . 超级恒温水浴锅 南京桑力电子设备厂 .型恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 . 电子精密天平 梅特勒.托利多仪器上海有限公司 微量注射器 上海安亭电子仪器厂 电泳电源 北京市六一仪器厂 电泳仪 . 美国.公司 乱 型高效液相色谱仪 美国乱公司 .实验方法 ..蛋白质浓度测定及标准曲线的制作 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法 .,。 ...标准蛋白质 配制咖的牛血清白蛋白溶液作为标准蛋白质溶液。 ...考马斯亮蓝一 取 考马斯亮蓝一溶于 %/乙醇中,充分搅拌溶解后,加入 %,磷酸,将溶液用蒸馏水稀释到,滤纸过滤,备用。 ...标准曲线制作 按表.顺序,分别加入对应试剂,反应后,在下测定光吸收 值。以光密度值为纵坐标,以蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线。 标准曲线公式:..,.。 表.蛋白质含量标准曲线 ? , ..酶活力的测定 参照伊德林等人测定双胸蚓纤溶酶活力的方法略加修改伊德林,, 可平 行应用于定量测定活力。此法具有稳定高、重复性好,所需设备 试剂少的优点, 单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 适用于在层析过程中方便快捷地检测酶活力。 ... 一酚试剂的制备 ?试剂甲: 蒸馏水中。 : , 、. ?溶解于 ?溶解于蒸馏水中。 :. 每次使用前,将份和份混合,即为试剂甲。 ?试剂乙: ?和 ?, 在磨口回流瓶中,加入 蒸馏水,再加 %磷酸,浓盐酸,充分混合,接上回流管, ,蒸馏水和数滴液体溴,开口继续煮 小火回流后,加入 沸,以便驱除过量的溴。冷却后溶液成黄色如仍呈绿色,须再反复 滴加 液体溴步骤,稀释至,过滤。滤液经标准滴定至终浓度为儿,置 于棕色试剂瓶?长期避光保存。 ...标准曲线的制作 酪氨酸溶 取支试管分成组,分别加,.,.,.,.,.和. 。每管再各加入. 一酚试剂甲, 液咖,各管补加蒸馏水至. 混匀,室温放置。再加入. .酚试剂乙,混匀,室温放置后于 处测其吸光值。以“管调零,测定光密度值,三组数据取平均值后以光密 度值为纵坐标,以酪氨酸浓度为横坐标绘制标准曲线。 标准曲线公式:..,.。 ...酶活力测定步骤: 取. .?和. ?缓冲 %酪蛋白溶液./ 液.几.至两个离心管对照管和测定管,在?水浴预温, 取.酶液于测定管中,摇匀,充分反应,在对照管和测定管中同时加入 . %三氯乙酸终止反应后,吸取与测定管等量的反应酶液至对照管中,两管静 置,?离心。取试管支,标记为测定管,对照管和空白管, 然后分别取离心上清液.至对应各管中,空白管加入.蒸馏水。后续步骤 同标准制作。以测定管一对照管的光吸收差值,查标准曲线所求得的酪氨酸数即 为水解酪蛋白生成的酪氨酸。酶活力定义单位为:?,.条件下每单环刺蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 内生成酪氨酸为酶活单位。 计算方法:酶活力酪氨酸微克数/反应时间×稀释倍数。 ..粗酶的制备 取鲜活的单环刺蜢虫体,尽量排去其体内海水,剖开体壁,收集体腔液于? 下 /离心,取上清液过目绢布除去脂类不溶物,滤液经超滤 截留分子量, 以上部分,冷冻干燥得粗制品。 ..酶的分离纯化 ... 一凝胶过滤层析 粗酶粉用./瞄. .缓冲液配制成%上样液,?下离 × .柱体积 的%上样分离,三蒸水洗 心,按 脱,洗脱速度/,/管收集,逐管测定酶活力,收集活性组分,超滤浓 缩用于下一步分离。 ... 离子交换层析 经浓缩的活性组分上已用. .平衡过的离子交换柱 儿. / ×. ,用含../ 的.缓冲液. .梯度洗 脱,洗脱速度./,甜管收集,逐管测定酶活力,收集活性组分备用。 ... 一凝胶过滤层析 .凝胶柱体 上步收集的活性组分经聚乙二醇浓缩后,按巧 积×.的%上样,三蒸水洗脱,洗脱速度./,/管收集。逐 管测定酶活力,活性组分收集冻干一?保存。 ..酶纯度鉴定及分子量测定 ...纤溶酶纯度的鉴定 采用?电泳和两种方法对分离得到的纤溶酶进行纯度鉴定。 ..电泳鉴定其纯度 电泳试剂配制 .储存液 单环刺蝣纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 .吖.:称取嘣 ?./, .溶解于三蒸水中,加浓 ,缓慢搅匀,调值至.后,定容至。 ?,. .嘶.:称取% .溶解于三蒸水中,加浓 ?./, / ,缓慢搅匀,调值至.后,定容至。 ?%/,室温保存周:称取.的,加蒸馏水至。 ?.%/溴酚蓝:称取溴酚蓝,加蒸馏水至,搅拌直至完全 溶解,过滤除去聚合的染料。 %的甘油,加入蒸馏水。 ?%州甘油:倒取 ?%过硫酸铵:.过硫酸铵;蒸馏水,可在密封的管内?存放数月。 ,加蒸馏水定容至,值应 ?电泳缓冲液:嘶碱,.甘氨酸, 为.左右。 %,. ?×样品缓冲液:. .%溴酚蓝,.晡./, .,. %甘油,共.,分装成小份/份,室温保存。使用前 每小份中加入此的.巯基乙醇即可。 .工作液 ?%/丙烯酰胺储存液:.丙烯酰胺,.双丙烯酰胺,加蒸馏水 至,搅拌至完全溶解,用石蜡膜封口,以保持溶液状态。 ?染色液:.考马斯亮蓝,甲醇、冰醋酸,加 蒸馏水配制成 染色液备用。 ?脱色液:甲醇、冰醋酸,加蒸馏水配制成 的脱色液备用。 %丙烯酰胺储存液,.嘣? ?%分离胶的配制:. ./, .,.蒸馏水,此%,此%过硫酸铵,“ 混合均匀。 %丙烯酰胺储存液,.嘶./ ?%浓缩胶配制:. .,.蒸馏水,此%,此%过硫酸铵,此混合均 匀。 .标准蛋白:标准蛋白分子量见表? 表?标准蛋白及分子量 ?单刺蜡纤溶酶的分离纯化及其药敛学的研究 ? 曲 . 兔磷酸化酶. 牛血清白蛋白 . 兔肌动蛋白 牛碳酸酐酶 讪 . 胰蛋白酶抑制剂 . 鸡蛋清溶菌酶 ?沁 电泳条件 采用垂直凝胶电泳。浓缩胶浓度% ,分离胶浓度% ,交聪度 %。电极缓冲液为. 。浓缩胶电压为,电流为,分离胶 电压为,电流为。屯泳时问。结束后用 %考马斯亮蓝一染 色,%乙酸脱色过夜。电泳过程中电泳槽置丁冰浴中。 电泳样品为粗酶品 ‖。,纯化后酶 ‖,标准蛋白质.。 鉴定其纯度 采用美国鸺公司的? 型高效液相色谱仪,? ,, 凝胶柱,柱温?,上样浓度 %,上样体积止,流速为 流动相为五蒸水,示差检测。 酶分子量的测定屯泳所需试剂和电泳条件与 所述相同。以标准 蛋白质电泳条带相对迁移 率绘制标准蛋白质分子量标准曲线,查标准曲线得分子量。 实验结果酶粗品的制备 经 所述处理步骤后,获得粗品粉末,样品呈暗红棕色。见图? 图?纤溶酶粗鲍干粉 刚 ? 抛舢“, 单环剌蜢纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 ..纤溶酶的分离纯化 制备的粗酶干粉经第一步?凝胶过滤层析后,分离得到个蛋白峰。 逐管测定酶活后,发现仅在?管间具有酶活,收集此部分洗脱液。 结果见图?。 . 加 . 印 . 卯 . ? ? “ 《. ? 一山,?姆嚣 . 加 . ?、吩?帝舻母夸母夺一 收集管数詹 图. .凝胶过滤层析 咖 .? 铲一分离得到的活性组分经过离子交换层析后,结果见图?。 从左至右出现四个蛋白峰,逐管检测酶活力,发现、、三个洗脱峰 均具有酶活 力,但峰酶的比活力远高于峰和峰。故选峰活性组分进一步分离 纯化。 . ? . ? . ? . ? ? 《. 『烬齄 ? . 帕 .收集管数/管 图. 一离子交换层析.? ? 伊印 从离子交换层析获得峰活性组分,经聚乙二醇浓缩后,上 ?凝胶柱,洗脱后仅有一个蛋白峰且具有酶活力。结果见图?。 单环刺蜡纤溶酶的分离纯化及其药效学的研究 . ? . . 耋 ? 穴 割 烬 . 溢 . 收集管数.,管 图. 凝胶过滤层析 巧 一 啪 . ..分离纯化小结 .凝胶层析柱、离子交换柱和 单环刺嗌粗酶依次经过 一三步柱层析后,得到一种酶组分,比活力达./,纯化倍 数为.,回收率为.%。结果见表?。 表? 的纯化结果 . ..酶纯度鉴定及分子量的测定 纯化后的酶组分经?电泳,在附近呈现为单一区带,结果如图? 所示;示差检测图谱如图?显示,纯化组分在.处呈单一峰,由色 谱峰面积计算其相对百分含量约为%。 单环刺蝼纤溶酶的分离纯化厦苴药教学的研究 以标准蛋白对其相对迁移率作图.得标准蛋白质曲线方程为一. 图 。将纯化后的酶组分迁移率 代人方程计算,得其分子量为 ,与 图谱所示的该酶分子量相一致。 ,‘