肾活检组织系膜细胞的培养和鉴定

肾活检组织系膜细胞的培养和鉴定 辱腹匏嘶缪之裕1 深圳医学1999年第l2卷第6期 一 6肾活检组织系膜细胞的培养和鉴定 登戴勇 罩圳市人民医院中心实验室58.2.R" 【摘要】目的"白体肾,P球系膜细胞做为转基因的载体,建立肾活检组鲺糸膜细胞 培养的方法.方法 5劁肾穿霄_I组织,用:皂DMEM培养液进行培养.结果建立了肾穿刺组织乐膜细 经组鲺学 胞培养方法, 和免疫组化鉴定寿^体系膜细胞.结论为肾痛的基固治疗提供了一种台疗性的白 身移植载体. I关键词】肾穿刺组织系膜缅胞培养鉴定 Stablishmentandidentifyofglomerualmesangialcellculturedinvitrofromreoal biopsytissues.LfFltfoni~,oiHui,DaiYong.Medicalfes【rchcemfe.shen曲 enPeople'sHospital, Shenzhen.5l8o2o [Abstract]ObiectiveToobviatetheproblemofrejectioninsitutationwherecellsareused asvectorsforgenedelivery.thefeasibilityofusingautologousmesangialcellcnturedfromtenal biopsyspecimenswasstudied.Methods5specimensfrumrenalbiopsywereculturedwithsdective DMEMcultureliquid.ResultsMethodsofglomeralmesangialcellculturedinvitrowasestablished. ThesecellswereidentifiedforhumanMCwithmicroscopicalobservationsandimmunohisto chemical method.ConclusionTheuseofautologousmesangialcellsfrombiopsyspecimensgenevect orfor nephropathygeneticallythery. ]Keywords]RenalbiopsytissueMCCultureIdentify 肾小球系膜细胞做为基因转移的载体,是 未来基因治疗肾脏疾病的力法之一.即从分离的 肾小球建立系膜细胞,在体外经基因工程修饰使 其表达外源基因产物,然后通过肾循环转移到肾 小球,最终到达有效位点,特异性地转移外源基 因到肾小球.使基因在体内持续表达.异体肾小 球系膜细胞作为基因转移的载体,在基因浩疗 时,存在免疫排斥问题,由于系膜细胞不同于其 它肾小球细胞,其本身有清楚的特性,可耻村 r肾活检组织进行系膜细胞培养,作为自身移植 导入外源性基因到肾小球的载体.本文探讨肾活 检肾小球系膜细胞的培养,鉴定的方法和条件. 1对象和方法 1.1对象 5例肾病患者,其中rI3倒,女性2例,常 规肾脏穿刺组织活柃,光镜标本观察俅小 球数目在1O个左{i. 1.2方法 1.2.1穿刺肾组织系膜细胞培养 常规穿刺肾组织,经0.1%胶原酶37?消化 30分钟,依次通过100目,200目筛,收集位 于200目上的肾小球,接种在含培养液的10ml 塑料培养瓶里,培养液有20%胎牛血清,0.66 /ml胰岛素,100u/ml青霉素,l00ngtml链 霉素及选择性培养基D.缬氨酸改良的MEM组 成.培养瓶置于5%CO.,18%O,孵箱内,6天后 首次换液,以后每2,3天换液1次,以除去脱 落死亡的肾小球表皮细胞(GEC).4周左右系膜 细胞接近铺满后,转至5Oral塑料细胞培养瓶中. 按常规方沾f0,j}li化敞为0.25%胰蛋白酶, 0.02%EDTA液. 1.2.2细胞株的冻存和复苏 第5代系膜细胞密集生i乇l『l,I先制成含细胞 5O万tml,JfJIl10%_二笨亚砜{DMSO),装 入细胞冷冻管内,密封.在.2O?放置8小时后, 移入.8O?低温冰箱过夜,次日放入液氯罐内分 别保存3,6个月进行复苏.复苏时,从液氯罐 内取出冷冻管,迅速投入37?温水中化椿,吸 出细胞液,移入细胞培养瓶静置培养,观察和估 算细胞复苏率. 1.2-3系膜细胞的鉴定 培养的系膜细胞形态学鉴定包括光镜,f 相显徽镜,透射电镜检查.?光镜,位相显微镜 观察系膜细胞的形态,结构;?细胞免疫组化方 法鉴定:将二分之一盖玻片置入培养瓶中,接种 系膜细胞.待系膜细胞铺满,取出盖玻片,用PBS 洗涤后甲醇固定5分钟,PBS冲洗3次.用抗 desmin抗体(抗系膜细胞中问丝抗体,Sigma产 品)进行间接免疫荧光染色,荧光显徽镜下观察 着色细胞i?透射电镜检查:用25%多聚甲醛 固定离心收集的系膜细胞团块,制成透射电镜标 本,观察系膜细胞内的微丝结构. 2结果 2.1肾活检组织系膜细胞的培养 5例肾穿标本经处理后,种植2,3天自'肾 小球周围长出多边形或卵圆形的肾小球细胞 (GEC).6--8天铺满瓶底,l0天左右死亡脱落. 之后,不规则星形或纺睡形的系膜细胞开始生 长,4周左右铺满瓶底.系膜细胞铺满后进行传 代,第一次传代后常有少量肾小球相伴随,但基 本上可去除GEC,用上述方法培养的系膜细胞 均已传到20代. 2.2系膜细胞鉴定结果 ?光镜细胞体呈梭形,星形或三角形;? 位相显徽镜细胞中央有一清晰圆形或卵圆形核, 核周胞质散布大量的细小颗粒?透射电镜胞 质内散布大量微丝和电子致密颗粒,徽丝常沿细 胞膜增多或呈带状分布?抗desmiu抗体均为 阳性,上特征证明所培养的细胞为系脱细胞. 2.3复苏率 储藏细胞复苏后.其细胞形态与传代细胞相 同,具有系膜细胞特征.复苏率约为70%--80%. 3讨论 肾小球细胞是一个复杂的细胞体,包括系 膜细胞,肾小球表皮细胞,肾小球内皮细胞(EC) 和肾小球壁表皮细胞.肾穿刺组织标本肾小球数 深圳医学1999年第l2卷第6期 目一般在lO个左右,分离与培养系膜细胞难度 较大,因此对肾小球的分离和收集是肾穿刺组织 系膜细胞培养的技术关键.对穿刺组织用0.1% 胶原酶消化肾小球外囊时,需注意温度和时间. 由于肾小球数目较少,种植的培养瓶应用10ml 塑料细胞培养瓶,利于贴壁和生长.在20%胎 牛血清条件下生长状态较好.EC属于高度分化 的细胞,在通常采用的培养条件下很难生长. GEC在培养6天后逐渐脱落,代之是系膜细胞. 为了防止成纤维细胞污染,本研究采用D.缬氨 酸选择培养液培养细胞,由于成纤维细胞内缺乏 转化D-缬氨酸时,不能获得L.缬氨酸.合成蛋 白质和生长增殖.系膜细胞具有转化D.额氨酸 的作用,它能在D一缬氨酸培养液中继续生长增 殖. 我们培养的系膜细胞光镜下形态及免疫荧 光检查,均与国外报道相一致f.肾穿刺组织系 膜细胞培养方法的建立,为肾病的基因治疗提供 了一种治疗性的自身移植载体.应用自身系膜细 较其它方法有如下优 胞作为基因治疗的工具, 点?取村容易.?防止自身免疫排斥反应,有 利于外源性基因在体内持续表达.?细胞生长旺 盛,因而细胞获得率高. 本研究建立的肾穿刺组织系膜细胞的培养 方法,为肾脏疾病的转基因治疗提供了一种自身 移植转基因的载体. 参考文献 1KitamuraM,MitaraiT,MaruyamaN.et a1.Mesangialcellbehaviorinthree.dimen. sionalextracelhlarmatrix.KiudneyInt, l991,40:653 2邵征童织培养和分子细胞学技术.北京:北京 出版E1995,96 3HughCReceptor—mediatedEudocytosisof low—densitylipoproteinbyculturedhuman gilomerularcellsNephron,1990,55:292 4WheelerDC,PersaudJW,FeruandoR,eta1 Effectsoflow—densitylipoproteinon mesangialcellgrowthandviabilityinvitro. NephrolDialTransplant.1990,5:185