口蹄疫LPB-ELISA抗体滴度和中和抗体滴度符合性研究

口蹄疫LPB-ELISA抗体滴度和中和抗体滴度符合性研究 口蹄疫LPB-ELISA抗体滴度和中和抗体滴 度符合性研究 中国畜牧兽医2009年第36卷第1o期疾病防治?147? 口蹄疫LPB—ELISA抗体滴度和中 和抗体滴度符合性研究 李乐,苗海生,胡骑,朱明旺.,李华春 (1.云南省畜牧兽医科学研究所,昆明650224;2.云南省保山疫苗厂,保山678000) 摘要:血清中和抗体滴度的大小反映血清对病毒感染的中和能力,其是 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 疫苗免疫效果和病毒感染状况的重要指标, 而液相阻断酶联免疫吸附试验(1iquidphaseblockELISA,LPBELISA)是一种通过EIISA检测抗体滴度的方法,因此研究 LPBELISA抗体滴度和中和抗体滴度的关系对疫苗评价和理论研究有重要意义.本研究采用野外采集的90份牛血清进行 了中和试验和LPB-EIISA试验,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明中和抗体滴度和LPB-EIISA抗体滴度具有相关性,相关系数为0.642,但是试验证 明有41中和抗体阴性样品会被LPB—E1ISA检测为阳性,通过改变LPB-ELISA的阳性判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,采用抑制率>0.7的抗体 滴度计算方法和1/8判定标准,可以使改进的LPBELISA的计算结果和中和试验结果更好的符合,降低假阳性率,使LPB- EIISA更适合进行口蹄疫血清学监测和普查. 关键词:口蹄疫;液相阻断酶联免疫吸附试验;抗体滴度 :A文章编号:1671-7236(2009)100147O4 中图分类号:$852.659.6文献标识码 口蹄疫(footandmouthdisease,FMD)是由口 蹄疫病毒引起的可致多种动物共患的烈性传染病. 收稿日期:200904—03 作者简介:李乐(1968一),男,云南人,副研究员,硕士,主要从事 动物病毒学研究. 通信作者:李华春.Email:htmlile@hotmail.corn 基金项目:云南省应用基础研究面上项目(2007C255M);云南 省科技攻关项目(2003NG06). …,一一…一…一一,一一l' 鸡免疫水平较高时(7.33log2),其子代9日龄时母 源抗体也很高(5.83log2),15日龄时则较低 (4.12log2).再次注射疫苗后,125日龄又降至 4.1log212.~下.因此,建议雏鸡在15日龄时进行首 免;在1l0b125日龄时进行第2次免疫或第3次免 动物感染口蹄疫病毒或免疫口蹄疫疫苗后都会产生 抗口蹄疫病毒的多克隆抗体谱系,其中包括能和病 毒感染相关位点结合的中和抗体,中和抗体能阻止 病毒的感染和在体内的传播,其滴度大小体现了血 清对病毒感染的中和能力(McCullough等,1992, Mateu,1995).可通过微量细胞病毒中和试验(vi— rusneutralizationtest)检测血清中中和抗体滴度, 来评价动物对口蹄疫的免疫能力,对口蹄疫疫苗 疫.实际工作中也应根据鸡群抗体水平来制定更为 科学的免疫程序. 由于诊断试剂条件所限,Re一1株,Re一4株未作 单独抗体效价对比. StudyonImmunogenicityofH5SubtypeHighlyPathogenicAvianInfluenza InactivatedVaccineinDifferentDay—oldPoultry LIFeng—yi,XUFeng,L1Fen.,LIUYu—jie (1.RizhaoCityinShandongProvinceAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Rizha o276800,China; 2.DonggangDistrictVeterinaryStationinRizhaoCity,Rizhao276800,China) Abstract:Toidentifythematernalantibodyandimmunedynamicsofavianinfluenzavirus,th elayersofdifferentagewere immunized,andconductedtrackingdetectiontOprovideascientificbasisforthescientificde velopmentoftheimmuneprocessof poultry.Theexperimentalresultsshowthatthelevelofmaternalantibodiesinchickensisrelat edtOtheantibodylevelofbreed— inghens,HIantibodylevelsofH5subtypeofavianinfluenzaofbreedinghensandmaternalant ibodiesofoffspringriseandfall indirectproportiontOthelaw. Keywords:highlypathogenicavianinfluenza;inactivatedvaccine;poultry;immunogenicit y ?148?疾病防治中国畜牧兽医2009年第36卷第1O期 研究和病毒感染研究有重要意义.但由于血清中和 试验需采用活病毒,一般实验室不能采用该方法,因 此常常用其它的检测方法取代,如正向间接血凝试 验和琼脂扩散试验,液相阻断ELISA(LPB— ELISA),固相EIISA(Hamblin等,1987;Mackay 等,2001)等.但是这些方法检测出的抗体不一定是 中和抗体,有必要研究这些方法检测出的抗体滴度 和中和抗体滴度的关系.其中LPB—ELISA是国际 上较常用的方法,因此笔者对LPB-ELISA与血清 中和试验的关系进行了研究. LPB—ELISA是用固定含量的病毒抗原来和待 检血清中的抗体反应,如果抗体量较少或没有,抗原 就不能够被抗体完全封闭,多余的抗原可用ELISA 方法测量出来,结果表示为抑制率,如果血清100 与抗原结合,抑制率就为100%.待检血清经过倍 比稀释后,总有一个稀释度不能完全和抗原结合,抑 制率为50的血清稀释度为LPB—ELIA抗体滴度. 如果待检血清的IPB—ELISA抗体滴度大于1:32, 该血清为LPB—ELISA抗体阳性,表示动物接触过 口蹄疫抗原. 为研究中和抗体滴度和IPB—EIISA滴度的关 系,包括计算中和抗体滴度大小和LPB—ELISA滴 度大小的相关性,查明血清中和抗体阳性率和LPB— EIISA抗体阳性率的数值区别,笔者在云南边境一 带采集了9O份牛血清,同时进行中和试验和LPB— ELISA试验,把获得的数据进行比较,发现如果改 变LPB—ELISA的血清判断标准,可以使中和试验 结果和LPB—ELISA结果更加符合. 1材料与方法 1.1LPB—ELISA试剂LPB—ELISA试剂由泰国 OIE东南亚口蹄疫参考实验室Wailiai博士提供. 1.2缓冲液相关缓冲液如下:包被液为碳酸缓冲 液(无水Na2CO3,1.59g,NaHCO.,2.95g,加超滤 水至1L),用于包被兔抗;0.01mmol/L磷酸缓冲 液(PBS,pH7.6)用于抗原血清稀释,同时用作洗 液;PBST用于豚鼠血清和兔抗豚鼠血清的稀释 (O.01mmol/I,pH7.6,PBS加5脱脂奶粉,1 Tween一2O);柠檬酸缓冲液用于配制TMB显色液 (Sodiumacetate,8.2g溶于Distilledwater,100 mL,配好后用1mmol/LCitrateAcetatebuf{er调 pH至5.6);0.01TMB用于显色;1t~mol/I的硫 酸用于显色终止. 1.3LPB—EIISA方法用兔抗146S血清(1: 2000)包被ELISA96孔板,同时用另外一块板进行 血清和标准抗原的中和反应.采取倍比稀释的方法 将待检血清稀释,然后加入等量的抗原在37?条件 下中和反应1h,将抗原和血清移到清洗好的包被 板中,1h后洗板,加入豚鼠抗146S血清(1:1000) 作用1h,洗板后加入辣根过氧化物标记的兔抗豚 鼠血清,40min后用四甲基联苯胺(TMB)进行显 色,20min后加入lmol/L硫酸终止显色,在 ELISA读板仪上用450nm波长读板获得结果. 1.4LPB—ELISA结果计算?抑制率:抑制率一1 一 样品D值/抗原D值,样品D值为血清和抗原中 和后测量获得的D值,抗原D值为单独测量抗原获 得的D值.?血清LPB—ELISA抗体滴度计算:首 先需要确定阳性孔判定方法(如0.5判定方法中,抑 制率>O.5样品孔为阳性孔),统计不同稀释度阳性 孔出现数量,用Spearman—karber方法计算血清滴度. 1.5动物血清微量细胞中和试验结果9O份牛血 清采于中缅边境地区,使用微量细胞中和试验方法测 定中和抗体滴度,其中70份中和抗体阴性(抗体滴度 <1:32),20份中和抗体阳性(抗体滴度>1:32). 2结果 2.1中和抗体滴度和LPB,ElISA滴度关系将 9o份牛血清的LPB—ELISA滴度和其对应的中和抗 体滴度作比较,用SPSS软件进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 .结果表明, LPB—ELISA和中和抗体滴度显着相关(P<0.01), r一0.642.为了进一步考察中和抗体滴度和LP ELISA滴度线性关系,采用有中和抗体滴度读数的 20份中和抗体阳性血清和LPB—ELISA抗体检测结 果进行线性关系分析,计算结果表明,LPB-ELISA 滴度和中和抗体滴度具有线性关系(P<O.01,SPSS 软件计算)(图1),线性方程为Y=1.57+0.68X,其 中X为中和抗体滴度,Y为LPB—ELISA滴度. l0 8 龟 三 . 涎 舞 置4 当 2 0 中和抗体滴度(1og2) 图1中和抗体为阳性的抗体滴度和LPB- ELISA抗体滴度的关系 中国畜牧兽医2009年第36卷第1O期疾病防治?149? 2.2样品的LPB—ELISA阳性率计算9O份牛 血清按标准的判断方法(Hamblin等,1987)进行 了LPB-ELISA检测(即用5O的抑制率进行血 清滴度终点判断),结果20份中和试验阳性血清 中,19份LPB—ELISA为阳性,1份为可疑(滴度 为1:32).70份中和抗体阴性血清中,29份检 测为阳性,17份可疑(滴度为1:32),24份阴性 (表1). 表190份血清样品的LPB-ELISA检测结果(份) 2.3改变LPB—EIISA阳性判断方法中和抗体 的阴阳性分布和LPB—ELISA抗体的阴阳性分布有 一 定区别,为了提高2种试验方法的符合性,尝试改 变LPB—EIISA滴度计算方法和阳性判断指标,结 果表明相同LPB—ELISA数据采用不同的抑制率进 行血清稀释度终点判断可得出不同结果(滴度表 示),如表2所示.为了进行血清阴阳性的判断,根 据中和抗体阳性的样品LPB—ELISA也应该是阳性 的标准和表2的结果,把阳性标准规定为:按7O 抑制率计算时,滴度大于l:8为阳性,1:8血清为 疑似阳性血清,需要进行重复试验;按60抑制率 计算时,滴度大于1:16为阳性,1:16血清为疑似 阳性血清,需要进行第二次试验确认;50%抑制率计 算时,按LPB—ELISA标准进行. 2.470份中和抗体阴性血清的LPB—ELISA试验 不同抑制率计算结果按7O抑制率计算时,70份 中和抗体阴性血清中,24份为阳性,疑似阳性血清 13份;按60%抑制率计算时,有23份为阳性,疑似 阳性血清17份;按50%抑制率标准方法计算时,29 份为阳性,疑似阳性血清17份.试验结果表明,按 7O抑制率计算的结果比标准的LPB-ELISA计算 方法结果有更好的中和抗体符合性. 表22O份中和抗体阳性血清LPB—ELISA检测抗体滴度数量分布结果(份) LPLVEL1SA滴度按7O抑制率计算按6O抑制率计算按5O抑制率计算 1;2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 阳性判断 O O O O O O O 0 0 表370份中和抗体阴性血清LPB—ELISA检测抗体滴度数量分布结果(份) LPB—EIISA滴度按70抑制率计算按60抑制率计算按50抑制率计算 862 ?5lr 125,r ::: 总 ; .150.疾病防治中国畜牧兽医2009年第36卷第1O期 注:按50抑制率计算方法为标准LPBELISA结果统计方法. 3分析和讨论 LPB—ELISA方法可以完全检测出口蹄疫中和 抗体阳性血清,LPB—ELISA抗体滴度和中和抗体滴 度相关性为0.642,比目前其它方法高,因此该方法 在边境地区具有良好的应用前景. 本试验中IPB—ELISA方法把41%中和抗体阴 性血清检测为阳性,因此LPB—ElISA结果可能在 疫苗研究中会存在一定的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 .笔者认为可能和样 品来源有关,由于样品来源于云南边境地区,这里的 动物背景情况比较复杂,流动频繁,与境外动物混合 放养的情况时有发生,而且每年按规定要进行高密 度口蹄疫疫苗免疫,动物很有可能接触过口蹄疫抗 原,但是产生的血清中和抗体滴度不高,而ELISA 比较敏感,所以中和抗体阴性的血清LPB,ElISA 可能是阳性.中和抗体滴度能够反映血清对病毒感 染的中和能力,LPB—ELISA抗体滴度水平是否与动 物发病有关需要进一步的研究. 本试验证明当改变IPB—EIIS.A的阳性判断方 法时,如提高抑制率判定标准,LPB—ELlSA检测出 的血清阳性率和中和抗体阳性率符合性有一定提 高,试验提示在动物背景情况比较复杂的情况下,可 能需要降低LPBELISA的敏感性来提高准确性. 参考文献 TheRelationbetweenLPB-ELISAAntibodyTitersand NeutralizatiOnAntibodyTitersofFMD LILe,MIAOHai—sheng,HUji,ZHUMing—wang.IIHua—chun (1.YunnanAnimalHusbandryandVeterinaryScienceResearchInstitute,Kunming650224,China; 2.YunnanBaoshanVaccinePlant,Baoshan678000,China) Abstract:Theserumneutralizingantibodytiterreflectstheserumneutralizationabilityonvirusinfection.Itisoneofthe importantparametersforvaccineandvirusinfectionevaluation.LiquidphaseblockEIISAisamethoddetectingantibodytiter bytheE1ISA.SorelationshipbetweenLPB-EIISAantibodytitersandneutralizingantibodytiterisvaluableinvaccinesand theoreticalstudy.Inthisstudy,90bovineserumwhichwereal1collectedfromfieldwereusedtOdoLP13-ElISAtestandneu— tralizingtest.TheresultsshowedthattherewascorrelationbetweentheneutralizingantibodytiterandtheIPB-EIISAtiters. Thecorrelationcoefficientwas0.642.But41testedantibody— negativesamplesdetectedbytheLPBE1ISAwaspositive.By changingthecriteriaofLPBElISApositive,usingsuppressionrate>0.7calculationofanti bodytiterand1/8criteria.the LPB-ELISAresultsandtheneutralizingantibodytiterwereinbettercoincidence,thefalsepositiveratewasreduced,80that LPB-EIISAwasmoresuitableforfootandmouthdiseaseserologicalmonitoringandsurvey. Keywords:footandmouthdisease;liquidphaseblockingenzymelinkedimmunosorbentassay;antibodytiter 一,,一,,一一,,一一一,,,一,,一一一,一一,,一一,一一一, 一一,,,一,,一,一,一,一,一,一一一一,一一一,一一一一一一一 一一一一一..,一,一一一一一一一一一一一,一一一l23_)