载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影响

载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影响 载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影 响 赵广荣等载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影响第l0期 andcorrelationtoadhesionmoleculeexpressionofhumanCD34'cell fromsteady—statebonemarrowandperipheralbloodmobilizedfollowing GCSF—supportedchemotherapy[J].StemCells,1998;16:271-9. 5WatariK,AsanoS,ShirafujiN,eta1.Serumgranulocytecolonystimula- tingfactorslevelsinhealthyvolunteersandpatientswithvariousdisorders asestimatedbyenzymeimmunology[J].Blood,1989;73:117-20. 6ShyuWC,IjnSZ.YangHI.eta1.Functionalrecoveryofstrokeratsin— ducedbygranulocytecolonystimulatingfactorstemcells[J].Circulatian. 2004:110(13):1847-54. 7KimB,SeoJH,BubienJK,eta1.Differentiationofadultbonemarrow stemcellsintoneumpmgenitorcellsinvitro[J].Neuroreport.2002;13: ll85-8. 8YanqingZ,YuminL,JianQ,eta1.Fibronectinandneumpmtectiveeffect ofgranulocytecolony—stimulatingfactorinfocalcerebralischemia[J]. BrainRes,2006;1098(1):161-9. 9尹小健,赵斌,邢永前.急性脑梗死患者自体外周血造血干细胞水 ? 969? 平及其与神经损伤的关系[J].中国老年学杂志,2005;25(11): 1296-8. 10PaczkowskaE,LaryszB,RzeuskiR,eta1.Humanhematopoieticstem/ progenitor-enrichedCD34cellsaremobilizedintoperipheralblood duringstressrelatedtoischemicstrokeoracutemyocardialinfarction [J].EurJHaematol,2005;75(6):461-7. 11YongK,FaheyA,ReeveL,eta1.Cordbloodprogenitorcellshavegrea— tertransendothelialmigratoryactivityandincreasedresponsestoSDF—l andMIP-3betacomparedwithmobilizedadultprogenitorcells[J].BrJ Haematol,1999;107(2):441-9. 12GoolsbyJ,MartyMC,HeletzD.eta1.Hematopoieticprogenitorsexpress neuralgenes[J].ProcNat]AcadSciUSA,2003;100(25):14926-31. [2008-02-02收稿2008-04-29修回] (编辑胡国义) 载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影响 赵广荣肖敏李欲来张军平(天津大学化工学院制药工程系,天津300072) [摘要]目的探讨载脂蛋白(APO)A4基因多态性与芪参益气滴丸治疗气虚血瘀型 冠心病疗效的关系.方法气虚血瘀型冠心病患者49 例,门诊服用芪参益气滴丸1个月,治疗前后各抽取血样一次,测定血脂含量并提取 外周血白细胞DNA,PCR扩增ApoA4基因第3外显子.测序检测 多态性位点.结果在ApoA4基因的第3外显子中发现1个有义突变位点,第917位 碱基c—T的突变,减弱了药物对LDL的降低作用,在非突变组 比突变组之间达到极显着差异(P:0.OO9).结论ApoA4基因C917T多态性对芪参 益气滴丸降低低密度脂蛋白(LDL)有显着影响. [关键词]载脂蛋白A4;单核苷酸多态性;芪参益气滴丸;气虚血瘀型冠心病 [中图分类号]IO32[文献标识码]A[文章编号]1005-9202(2008)10-0969-03 EffectsofsinglenucleotidepolymorphismofApoA4geneonbloodHpidregulatedbytraditio nalChinesemedicine ZHAOGuang-Rong,XIAOMin,LIYu-Lai,eta1. DepartmentofPharmaceuticalEngineering,SchoolofChemicalEngineeringandTechnolo gyofTianjinUniversity,Tianjin 300072,China 【Abstract】 ObjectiveToexploretherelationshipbetweenthepolymorphismofApoA4geneandefficacy ofQishenbenefitingvital energydroppillonqiastheniabloodstasiscoronaryheartdisease(CHD).MethodsTotal49qia stheniabloodstasisCHDpatientstaken Qishenbenefitingvitalenergydroppillfor1monthweresampledtoobtainthebloodspecimenbeforeandaftertreatmenttodetectthecontent ofbloodfatandextractDNAfromleucocyteofthebloodsamples,andamplifythethirdextronofApoA4genebypolymerasechainreaction. Thepolymorphicsitewasdetectedbysequencing.ResultsAplussensemutantsiteAPOA4C917Twasfoundinthetl1irdextronofApoA4 gene,andtheefficacyofreducingLDLinthenonmutantgroupwashigherthanthatinthemutantgroup(P=0.009<0.01).Conclusions ThenonsynonymousmutantsiteAPOA4C917TcansignificantlyaffectthedecreasingefficacyofQishenbenefitingvitalenergydroppillon lowdensitylipoprotein(LDL)content. 【Keywords】 ApolipoproteinA4(ApoA4);Singlenucleotidepolymorphism;Qishenbenefitingvitalenergydroppill:Qideficiency bloodstasiscoronaryheartdisease 冠心病发生发展的相关因素很多,其中血脂代谢紊乱是已 被公认的危险因子之一'".载脂蛋白A4(ApoA4)可促进胆固 醇从肝外组织和细胞向肝内的转运,从而加速胆固醇的代 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371712) l天津中医药大学 作者简介:赵广荣(1966一),男,教授,硕士生导师,主要从事生物技术制 药研究. 谢.ApoA4通过胆固醇的代谢影响血脂代谢,因此成为研究冠 心病的重要功能基因.ApoA4基因定位于染色体11q23,长 2594bp,含3个外显子和2个内含子,其中第3外显子的多态 性与冠心病的关系密切.已经发现第127l4J,347和360位 碱基突变使得其编码的氨基酸发生变化,并已经确定第347位 碱基突变会增加冠心病的危险性.气虚血瘀证是冠心病的 常见类型,芪参益气滴丸是适应于治疗该类型冠心病的中药复 方制剂药物.中药的疗效与ApoA4基因多态性之间是否存在 ? 970? 关系,目前还未见报道.为此,本文采用分子生物学技术,以芪 参益气滴丸为模型药物,从基因的多态性角度探讨该药物对血 脂的影响. 1对象与方法 1.1对象选择门诊收治的通过冠脉造影确诊的气虚血瘀型 冠心病患者49例,男15例,女34例,年龄41,80岁,平均 (59.24?8.63)岁.1个月后复查患者42例,脱失率为14%. 纳入 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :西医诊断符合1979年世界卫生组织国际心脏病学 会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组,冠心病 稳定性心绞痛临床诊断标准,病情稳定1个月以上.中医证候 诊断符合2002年《中药新药(冠心病心绞痛)临床研究指导原 则》中气虚血瘀证诊断标准.排除经检查证实为冠心病劳累性 心绞痛为?级,急性心肌梗塞以及其他心脏疾病,重度神经官 能症,更年期症候群,甲亢,颈椎病,胆心病,胃及食管反流等所 致胸痛者;合并重度高血压,心肺功能不全,心律失常,肝,肾, 造血系统等严重原发性疾病,精神病患者;妊娠或哺乳期妇女; 过敏体质及对多种药物过敏者. 1.2治疗方法维持患者原有基础降压及降糖药物,无降脂 药物.服用芪参益气滴丸(批准文号:国药准字Z20030139) ,3次/d,由天津天士力制药股份有限公司生产.自检 0.5g/次 查血液流变,血脂开始治疗1个月. 1.3质量控制 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 由专人进行相关知识 培训 焊锡培训资料ppt免费下载焊接培训教程 ppt 下载特设培训下载班长管理培训下载培训时间表下载 后进行问卷调 查,确保真实性,准确性,一致性,完整性;所有相关实验室检验 由专业人员专职检测;实验前对患者充分解释进行相关宣传, 提高其依从性;将化验结果在实验结束后统一将复印件交给患 者,避免患者中间加服其他药物. 1.4检测指标 1.4.1'丘L样的采集嘱咐患者检测前1d低脂低蛋白饮食, 抽血夸天早晨在进食水前采血.检测指标为TC,TG,HDL, LDL,VLDL,治疗前后各检测一次.TC,TG用酶比色法,HDL, LDE用清除法,均采用中生北控生物科技有限公司产品;VLDL 采用计算法,血糖采用葡萄糖氧化酶法,为保定长城临床实际 有限公司产品;以上用荷兰威图公司生产的95版半自动生化 仪检测. 1.4.2DNA的提取应用宝生物(大连)公司的BloodGe- nomeDNAExtractionKit提取基因组DNA,用0.8%琼脂糖凝胶 电泳鉴定DNA,保存于一20?备用. 1.4.3ApoA4基因第3外显子克隆根据人类基因组的序 列,设计引物5-GGGACAGACAGACAGACAGGTGG-3;5- ACAAAGTCTFGCCGTGTAAATCG一3.PCR总体系5Ol,10× PCR缓冲液5,TaqDNA聚合酶0.5,dNTP混合物4l,引 物各(20I~moVL)1l,模板DNA200ng,加双蒸馏水(ddH2O) 补齐至50l.PCR条件:95~C预变性3min,1个循环;95~C变 性60s,55~C退火50s,72~C延伸50s,共35个循环;最后于 72?延伸10min. 1.4.4测序PCR产物由上海生工生物工程公司在DNA测 序仪上进行全测序.通过ClustalW对基因的测序结果进行比 较找出突变位点. 中国老年学杂志2008年5月第28卷 1.5统计学方法对各血脂参数治疗前后的差值,采用 SPSS11.0软件,通过配对t检验分析突变组和非突变组之间的 差异显着性. 2结果 2.1ApoA4基因的PCR扩增见图1.以自细胞DNA为模 板,对ApoM基因的第3外显子的部分序列进行PCR扩增,然 后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.PCR扩增是特异性的,获 得的产物是唯一的.与DNA标准分子量相比,可知PCR产物 大小符合预期的1.1kb. 2.2ApoA4基因测序见图2.为了进一步确证PCR产物, 对其DNA进行测序,长度为1148bp.将该序列搜索GenBank 数据库,与ApoM基因第3外显子的相同性为99%以上, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 PCR产物是ApoA4基因的第3外显子.为了寻找突变位点,将 所得序列与数据库中的序列进行ClustalW比对,发现了1个 突变碱基,第917位c—T的突变,为有义突变位点.该位点突 变使氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺,在.NCBI数据库中没有记 录,也未见其他相关报道. bp 2000叶 1000 500—+ 1148hi, 1:DNAMarker;2,9:不同血样的PCR产物 图1ApoA4基因第三个外显子PeR产物的琼脂糖凝胶电泳 2.3ApoA4基因第917位碱基突变对疗效的影响见表1. 在有效纳入的治疗样本中,ApoM基因第917位碱基c—T的 突变率为81.58%.对突变组与非突变分组样本的血脂变化进 行统计学检验TC,TG,HDL和VLDL的变化在突变组和非突变 组之间无显着差异,而LDL的差值在突变组中明显偏低,相对 非突变组有极显着差异(P<0.01). 表1第917位碱基突变对血脂的影响 赵广荣等载脂蛋白A4基因多态性对中药降血脂的影响第1O期 (30lGAC~CT^G^TTCTC^GC^6CTTT^TT6^^T^TrG^G^6GTGGTCTC^CCTCCC^c T0G^C O6l^rGr6TCCTC^^GrTC^T^CCkC,A.ACTrcTTT0S6^CAGAC^G^c^G^c^0GGc;66 121CAGG6CkGGTGTCCACG~}GGTGGGGCCAGTGCACCC,CkGCTCKC,CTCTCC.JU~kC,G l8lr..,C,CCAC,C^TcTGc^ccTGcTccTr.,CTGCTGCTCCTGCTGCTGTTccTGCTGTTGCTCCAC, 24lCTCkC,C,Gkr_.,GGAGAGAGTCTTGTCCTGr.,CTCTCTTTCTCCTTGk/tGG,TC,CTG?G?lGG^ 30lGTTGACCTTGTCCCTCkGGTCCTTCrcC^GG蛐 GcTC^^GTGr.,CCTTCCkCGTCCOccC,C 36l^T0GG6GCCCkGTTTCTC,CCTG^6cTGTTCC^TCTGCTC,CACCAC,C,C,CTTTGTTGAjT 42lmCCCGTAGGr.,CTCCACCCGr.,CGTCC,GAACTCCTCC^cCTC,CTGGTCCkC..,GTC,CCC^CC 48lC^GCTCTGCCkG'TGA,CTTCTC,C^GCCCCTCC,GTG'TTGCCCCTCAGGTTC,CC^cGc^cGTC S4lCTCGr.,CCAAC,Gr..,CC,CC^GCCTCTGCCGc^GCrcCTCC.KICkCTGr.,CCGkG,kTccTGGCCTT 60lG^TCCTCGr-.,C~TCTTCTTCATCT0^^^C,GTC^CCTCTC,GTGGTTGkGCTT 66lCTCCTC,CGTGTCCTGkGCkTkr.~GAC,CCAC,C,CTC,CGr.,CC,C^6cTccTCC^CGGTCTGGTC 丁 2l^^TCTTr.,ACTTTG^^TTC,G"TC^6cGTkCK;GCGTA^GGcGTCCCTTG/~;CTccTCC^cGrT 78lCTGGTCG,kTCTTr.,C,CCTTG^C,CTCGTCGr.,C,G"T~CTCAC,CGAC,C,CCTGCkGr.,CTGTC 84lGr.,CGTTCTCCCC,CkC,C.^cTCTCTCCkTC,CGCTGrGcGT^6粥? rc^6cT~-'GCCC,C.AC, 901CTC,CTCr.,C,CCTGc田 G^ccTr.K?,GTGCGCkGCTC,GTCCC,CGTAC,Gr.,CTCCkGr.,Cr.CTG %lCTG^^GcTCTCC,CAGGTTGTccCCTTCTC.KICrc^cCTCATTC.KICATGGGGC ^6cAC, l02lccC,66CCCTC^GCTccTcc^GCTCCTTCcc^^rcTccrcCTTC^GTTTCTCCGkGTC c订 lo8lr.,C,CCkC.KICGTTCkTC,CAC,CToGGTGGc^^^C,C,C,C^cC^6cTTCTTCTGCk GGTC^cCTC,C l14lGTA^GTGTTC^CTTCTCCAAGTTTGTCCTGGA~GAGGGCkCTGTO;GGAA C,GC,CAC^^0G l20l^GGcC^cGTT^c^TTTGGc^TTTAC^cGGcAAr.,ACTTTGT 箭头所示为上下引物,加黑框阴影斜体字符为有义突变位点(917) 图2ApoA4基因第3外显子(1—1180bp)及PCR产物 (93—1240bp)的核苷酸序列 3讨论 芪参益气滴丸是由黄芪,三七,降香,丹参四味药物组方而 成.黄芪性味甘微温,降低胆固醇;三七可以明显降低血黏 度,降低血脂.芪参益气滴丸对气虚血瘀型冠心病患者可明 显改善血脂代谢,降低TC,LDL,VLDL.另一方面芪参益气 滴丸中的丹参,三七等具有显明的直接清除自由基等抗氧化作 用",因此,芪参益气滴丸对冠心病的治疗作用之一可能是通 过其降低血脂功能和抗氧化作用而实现的. ApoA4可能是冠心病和冠状动脉硬化的重要预警因 子…J,ApoA4在小肠中合成后被分泌到淋巴腺成为乳糜微粒 并且快速被载脂蛋白C转移".ApoA4由无脂区,与载脂蛋 白Al的结合区和脂质结合区组成,分别对应第1—3个外显子 编码的区域,其中第3个外显子编码的脂类结合区占84%13]. 低密度脂蛋白(LDL)的氧化过程是动脉粥样硬化形成的主要 步骤",氧化型低密度脂蛋白(ox—LDL)在脉管系统中起细胞 毒素作用,引发氧化损伤.Wong等"的实验表明,ApoA4 具有抗氧化作用,它结合在LDL上,抑制了LDL的氧化.这种 抗氧化作用具有位点特异性,不同突变位点对ApoA4抗氧化性 的影响不同.就从目前发现的3个位点来看,第347位碱基突 变减弱了其对LDL的保护作用,第360位碱基突变增加了其抗 氧化性作用,而第127位碱基突变对其抗氧化性没有影响. 本研究首次报道ApoA4基因第3外显子的第917位碱基突变, 使第147个氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺,这一突变减弱了药 物对LDL的降低作用,使药物的降LDL作用在非突变组比突 变组更有效. 在后基因组时代,个体化用药是提高疗效的重要手段,而 研究基因的多态性与药物疗效之间的关系是其关键.然而目 前研究主要集中在化学药物和其代谢酶P450的多态性上,其 他基因多态性的研究鲜见.本文发现ApoA4基因的多态性对 其载脂功能和药物疗效有显着影响,突变后的ApoA4是否通过 ? 971? 其抗氧化活性的变化,降低了药物调节脂质的代谢强度,值得 进一步深入研究. 4参考文献 1YusufS,HawkenS,OunpuuS,etaLEffectofpotentiallymodifiablerisk factorsassociatedwithmyocardialinfarctionin52countries(theINTER— HEARTstudy):case—controlstudy[J].Lancet,2004;364(9438):937-52. 2SteinmetzA,BarbarasR,GhalimN.et口LHumanapolipopmteinA—IV bindstoapolipopmteinA--I/A--IIreceptorsitesandpromotescholesterol effluxfromadiposecells[J].JBiolChem,1990;265(14):7859~3. 3DvorinE,CorderNL,BensonDM,eta1.ApolipoproteinA—IV:adetermi— nantforbindingandupmkeofhighdensitylipoproteinsbyrathepatocytes [J].JBiolChem,1986;261(33):15714—20. 4BoerwinkleE,VisvikisS,ChanLTwopolymorphismsforaminoacid substitutionsintheAPOA4gene[J].NuclAcidsRes,1990;18(16): 4966. 5TenkanenH,KoskinenP,MetsoJ,eta1.Anovelpolymorphismofapoli— poproteinA—IVistheresultofanasparaginetoserinesubstitutionatresi— due127[J].BiochimBiophysActa,1992;1138(1):27—33. 6WongWR,HaweE,LiLK,eta1.ApolipoproteinAIVgenevariant$347 isassociatedwithincreasedriskofcoronaryheartdiseaseandlowerplas— maapolipoproteinAIVlevels[J].CircRes,2003;92(9):969-75. 7付华,陈焕春,王东升.黄芪注射液对冠心病患者血液流变学及 血脂的影响[J].现代中西医结合杂志,2006;15(2):165.6. 8严学维.三七总甙片对高血黏度,高脂血症的疗效观察[J].上海中 医药杂志,1999;5:19. 9李欲来,张军平,赵广荣,等.芪参益气滴丸对气虚血瘀型冠心病患 者血脂影响观察研究[J].中华实用中西医杂志,2005;18(1O): 1421-2. 10向志军,赵广荣,元英进,等.复方丹参的体外抗氧化活性研究 [J].中草药,2006;37(2):211-3. 11WarnerMM,GuoJ,ZhaoY.Therelationshipbetweenplasmaapoli— poproteinA—IVlevelsandcoronaryheartdisease[J].ChinMedJ(En— g1),2001;114(3):275-9. 12GreenPH,GlickmanRM,SaudekCD,eta1.Humanintestinallipopro— teins~Studiesinchyluricsubjects[J].JClinInvest,1979;64(1):233— 42. 13EzehB,HaimanM,AlberHF,eta1.PlasmadistributionofapoA—IVin patientswithcoronaryarterydiseaseandhealthycontrols[J].JLipid Res,2003;44(8):1523-9. 14SteinbergD,ParthasarathyS,CarewTE,eta1.Beyondcholestero1.MOd— ificationsoflow—densitylipoproteinthatincreaseitsatherogenicity[J] . 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