.丙戊酸钠联合三氧化二砷对HL

.丙戊酸钠联合三氧化二砷对HL 睡前故事大全 【摘要】 目的:探讨丙戊酸钠(sodium valproate， SV)联合三氧化二砷(arsenous trioxide， As2O3)诱导HL-60细胞凋亡与bcl-2)bax mRNA之间可能的关系。方法:在对数生长期的HL-60 细胞中分别加入不同浓度的SV和1.0 μmol/L As2O3，采用MTT比色法测定细胞生长抑制率， 用Annexin V-FITC/PI双重标记经流式细胞仪检测细胞早期凋亡率，RT-PCR检测bcl-2，bax mRNA在细胞中的表达。结果:SV抑制HL-60细胞生长并促进其凋亡， SV联合1.0 μmol/L As2O3对HL-60细胞的生长抑制及促凋亡作用更明显。SV单独或联合1.0 μmol/L As2O3作 用于HL-60细胞，bcl-2 mRNA表达下降，bax mRNA表达增高。结论:SV与As2O3有协同作 用，抑制HL-60细胞生长并诱导其凋亡， bcl-2)bax mRNA的表达变化可能参与了SV对HL-60 细胞的促凋亡作用。 【关键词】 丙戊酸钠;三氧化二砷;HL-60细胞;凋亡;Bcl-2;Bax [Abstract] Objective: To study the growth inhibition and apoptosis of HL-60 cells affected by the combination of sodium valproate (SV) and arsenous trioxide (As2O3), and to explore the relationship between the apoptosis of HL-60 cells induced by the combination of SV and As2O3 and the expression of bcl-2 and bax mRNA. Methods: Various concentrations of SV and 1.0 μmol/L As2O3 were added to exponential growth HL-60 cells . MTT assays were used to measure the growth inhibitory effect of combination of SV and As2O3. Flow cytometry was used to evaluate their apoptosis. RT-PCR was adopted to measure the expression of bcl-2 and bax mRNA. Results: SV was able to induce growth inhibition and apoptosis in HL-60 cells. SV could enhance the growth inhibition and apoptosis induced by 1.0 μmol/L As2O3 alone. The expression of bcl-2 mRNA in HL-60 cells cultured with SV or the combination of SV and As2O3 decreased obviously, but the expression of bax mRNA increased. Conclusion: Combination of SV and As2O3 can synergistically inactivate HL-60 cells, inhibit the cell proliferation and induce apoptosis. The induction of apoptosis induced by SV or the combination of SV and As2O3 may be mediated by down-express bcl-2 mRNA and by up-express bax mRNA. [Key words] Sodium valproate; Arsenous trioxide; HL-60 cells; Apoptosis; Bcl-2; Bax 白血病是由于造血系统中某一系列细胞的异常增生，并在骨髓、肝、脾、淋巴结等各脏 器广泛浸润的造血系统恶性肿瘤。传统的化疗药物在杀伤白血病细胞的同时，对正常骨髓细 胞也产生不同程度的破坏。新型的化疗药物组蛋白脱乙酰基(histone deace-tylase，HDAC) 抑制剂在体外对多种肿瘤细胞系有抑制增殖、诱导凋亡及分化的作用，而对正常造血细胞无 严重毒性，且与多种现有化疗药物有协同作用[1]。丙戊酸钠这种长期在临床上被当作抗癫痫 睡前故事大全 药使用的支链羧酸制剂，近来被发现可以抑制HDAC，特别是?型HDAC[2]。本次研究旨在以急性髓系白血病细胞株HL-60为靶细胞，通过联合使用丙戊酸钠、三氧化二砷(As2O3)，观察丙戊酸钠对白血病细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨其作用的可能机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株 急性髓系白血病细胞株HL-60(中科院上海细胞生物所)。 1.1.2 药品与主要试剂 RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司);丙戊酸钠(SV)注射液(杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司); As2O3注射液(哈尔滨伊达药业有限公司);DMSO、MTT(美国Sigma公司); Annexin-V/PI细胞凋亡测定试剂盒、RT-PCR两步法试剂盒(上海晶美生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 将HL-60细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养体系中，在37?、5%体积分数的CO2、饱和湿度下培养，48~72 h传代1次。 1.2.2 MTT法 取对数生长期HL-60细胞接种于96孔板，每孔接种约1.5×103个细胞。实验分4组:对照组(只加培养液)、 SV组(SV的终浓度分别为0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L)、As2O3组(1.0 μmol/L)、SV+ As2O3组(SV的终浓度分别为0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L，As2O3均为1.0 μmol/L)。每组设3个复孔，24、48、72 h后检测。检测前4 h加入5mg/ml MTT 20 μl，继续培养4h后，水平离心，吸干上清，加入DMSO 150 μl震荡5 min，490 nm测定吸光度(OD值)。重复3次。细胞生长抑制率=(1,实验组OD值/对照组OD值)×100% 1.2.3 Annexin V-FITC/PI双重标记流式细胞仪检测细胞早期凋亡率 将对数生长期HL-60细胞接种于24孔培养板，根据所加药物不同分为4组:对照组(只加培养液)、SV组(SV的终浓度分别为2.0和4.0 mmol/L)、As2O3组(1.0 μmol/L)、SV+ As2O3组(SV的终浓度分别为2.0和4.0 mmol/L，As2O3均为1.0 μmol/L)。各组细胞培养48 h后，收集细胞悬液，离心，去上清，按Annexin-V/PI细胞凋亡测定试剂盒说明书操作，最后流式细胞仪检测凋亡率。 转贴于 233网校 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 中心 上一页1 2下一页 睡前故事大全 下一篇:壮筋补骨丸促进骨折愈合的临床研究 1.2.4 RT-PCR法检测bcl-2，bax mRNA在各组细胞中的表达变化 将对数生长期HL-60细胞接种于24孔培养板，分组及加药方法同凋亡检测。48h后，Trizol法提取RNA，应用RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit将2 μg总RNA逆转录成cDNA。根据GenBank bcl-2、bax基因序列和内参照GAPDH基因序列，利用Primer Premier 5.0软件，设计如下引物，由上海生工合成。bcl-2引物上游:5'-TTCGCCGAGATGTCCAGGC-3'，下游:5'-TCACTTGTGGCCCAGATAGG-3'，386bp;bax引物上游: 5'-GATGCGTCCACCAAGAAG-3'，下游:5'-GATCAGTTCCGGCACCTT-3'，243bp;GAPDH引物上游:5'-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游:5'-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，190bp。25 μl PCR反应体系:cDNA 2 μl， 10×PCR Buffer 2.5 μl，2 mmol/L dNTPmix 1 μl ，上、下游引物各1 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，TaKaRa Taq DNA 聚合酶0.25 U，ddH2O 15.75 μl。反应条件:94? 3 min，接着94? 45 s，56? 45 s，72? 45 s，共35个循环，最后72? 7 min。PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色照相，并用凝胶成像系统定量分析，以目的基因bcl-2、bax与内参照GAPDH -C mRNA的相对表达量。 条带的吸光度比值表示GC 1.2.5 统计学方法 所有数据均以??s表示，用Stata7.0软件进行方差分析，两两比较采用q检验。以P,0.05表示差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 MTT结果 不同浓度SV对HL-60细胞有不同程度的增殖抑制作用(图1)，与对照组比较，差异有统计学意义(P,0.05)。联合1.0 μmol/L As2O3对HL-60细胞的增殖抑制作用较单用SV或As2O3更明显(P,0.05)(图2)。结果提示随着SV浓度的增加和作用时间的延长，细胞抑制率增加。 2.2 凋亡率检测 见表1。 2.3 RT-PCR对bcl-2，bax mRNA的检测结果 单用SV或 As2O3降低了bcl-2 mRNA的表达水平，增加了bax mRNA的表达水平(与对照组比较P,0.05)。SV联合As2O3降低bcl-2 mRNA、增加bax mRNA表达水平的作用更显著(与单用SV或As2O3组比较P,0.05)(图3)。 睡前故事大全 3 讨 论 影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控，其分 子基础有2个方面:即针对DNA本身的修饰和对组蛋白的修饰。针对DNA本身的修饰以DNA 甲基化为代表,通过对DNA甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA甲基化状 研究最多的是乙酰化。许多研究已证实了组蛋白高态[3]。组蛋白的修饰比DNA甲基化复杂, ,低乙酰化在肿瘤发生中起重要作用。DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是目 前肿瘤治疗的热点。HDAC抑制剂抗肿瘤机制包括阻滞细胞周期和促进细胞分化，诱导细胞凋 亡，抑制血管生成等[4]。bcl-2基因家族的成员均参与调控细胞凋亡，所以它们与肿瘤发生 的关系被广泛研究。De Falco 等[5]和Raisova 等[6]通过不同实验研究发现,抗凋亡蛋白与 促凋亡蛋白的比例在一定程度上决定了细胞是否发生凋亡，bax/bcl-2高的细胞较bax/bcl-2 低的细胞容易发生凋亡。 通过本实验的研究表明:单用SV对HL-60细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用，SV联合1.0 μmol/L As2O3对HL-60细胞增殖抑制和诱导凋亡作用较单用SV或As2O3明显。SV与As2O3 的协同作用可能是由于As2O3能下调细胞内bcl-2的水平，从而降低了SV诱导细胞凋亡的阈 值[7]。同时结果还提示SV降低了bcl-2 mRNA的表达水平，增加了bax mRNA的表达水平， 与对照组比较有统计学差异;SV联合As2O3降低bcl-2 mRNA、增加bax mRNA表达水平的作 用更为明显，与SV或As2O3单用比较差异有统计学意义。 我们可以初步得出这样的结论:SV和As2O3能协同抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡， bcl-2)bax mRNA的表达变化可能在SV诱导 HL-60细胞凋亡的过程中发挥一定作用。这为我 们在临床上治疗白血病提供了新的思路和方法。另外是否还有其它机制在SV对HL-60细胞促 凋亡作用中发挥作用，如SV是否可能通过影响耐药基因的表达来发挥其诱导凋亡的作用，需 要我们进一步的研究来证实。 【参考文献】 [1] Tang R, Faussat AM, Majdak P, et a1. 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In vitro studies on cellular and molecular mechanism of arsenic(As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bcl-2 expression and modulation of PML-RARalpha/PML proteins[J]. Blood, 1996, 88?1052. 转贴于 233网校论文中心 上一页 1 2下一页 下一篇:壮筋补骨丸促进骨折愈合的临床研究