用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素

用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素 用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的 影响因素 贵州农业科学2009,37(8):28~30 GuizhouAgriculturalSciences [文章编号31001—3601(2009)08—0510—0028—03 用半定量RT—PCR法分析基因表达水平的影响因素 陈名红,陈毅坚,叶艳青,苏源,李成云 (1.云南民族大学化学与生物技术学院,昆明650031;2.云南农业大学农业生物多样 性与病虫害控制 教育部重点 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 ,昆明650201) [摘要]半定量逆转录聚合酶链式反应(Sem._QRT_PCR)以其灵敏,简捷及特异性高 等优点已逐渐成为分析基因表达 水平的一种有效手段.着重对用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的相关影响 因素进行了综合论述,并讨论了半定量 RT-PCR法在基因表达研究方面的应用潜力. [关键词]半定量逆转录聚合酶链式反应;基因表达;影响因素 [中图分类号]S188[文献标识码]A TheFactorsAffectingAnalysisofGeneExpression LeveIbySemi.QRT.PCRTechnique CHENMing—hong",CHENYi-jian,YEYan-qing,SUYuan.,LICheng—yun.' (1.TheSchoolofChemistryandBio-techniqueofYunnanNationalitiesUniversity.Kunmin g,Yunnan 650031:2.KeyLaboratoryofTheMinistryofEducationalforAgro-biodiversityandPestsCo ntrol,Yunnan AgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China) Abstract:Semi— QRT-PCRisarapid,simpleandhighlyspecificmeansinanalysisofgeneexpressionlevelinre cent years.ThispaperdescribesfactorsaffectinganalysisofgeneexpressionlevelbytheSemi-QR T-PCRtechnique comprehensively.andalsodiscussesthepotentialapplicationoftheSemi-QRT-PCRtechniq ueingeneexpressionresearch. Keywords:Semi—QRT-PCR;geneexpression;influencingfactor 高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活动 过程的主要机制,通过比较不同类型细胞或同一类 型细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的 基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信 息.半定量逆转录聚合酶链式反应(semi—quantita— tivereversetranscriptionandpolymerasechainre— action,Semi—QRT—PCR)是近年来常用的一种灵敏, 简捷及特异性高的基因表达水平的检测方法[1],其 原理就是将总RNA逆转录成cDNA,然后扩增目 标cDNA和内参cDNA,根据PCR产物量将目的基 因的量除以内参的量的比值计算样品中mRNA的 相对数量[{].与经典的检测基因的表达方法如 Northern印迹,RNase保护分析,原位杂交及S1核 酸酶分析等相比,半定量RT—PCR法具有灵敏度高 (比杂交法高1000,10000倍),专一性好,快速简 便,所需样品量少及耗费较低等诸多优点.然而,已 有的研究表明,由于用半定量RT-PCR法分析基因 表达水平的影响因素较多[6.,导致该法目前只能用 于粗略比较样品问的基因表达水平.因此,如何控 制影响半定量RT-PCR准确性的因素以提高半定 量RT-PCR法的可靠性是相关研究者需共同面临 的课题.为全面掌握半定量RT—PCR方法,提高基 因表达水平的分析能力,有必要对用半定量RT— PCR方法分析基因表达水平中的相关影响因素加 以综合分析. 1提取组织总RNA 1.1组织 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的预处理 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得 到全长的RNA,而实验失败的主要原因是RNA酶 的污染.在实验中,一方面要严格控制外源性RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA酶L8].由于样品离开活体或原来的生长环境 后,样品中的内源性的RNA酶即开始降解RNA, 降解速度与RNA酶含量及温度有关.因此,样品 取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至一 7O?冰箱保存.RNA酶极为稳定且广泛存在,其可 耐受多种处理而不被灭活,如煮沸,高压灭菌等,但 几乎所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤,手 指,唾液,试剂,容器等均可能造成污染,为此,必须 从获取标本开始就进行无RNA酶操作.通常的做 法是:实验人员一律戴上口罩和帽子,使用一次性手 套且经常更换;所用的器械及器皿必须经200?以 上的高温烘烤最少5h;不能用高温处理的塑料容 器,耗材等用0.1的DEPC水处理12,16h,再用 蒸馏水冲净;配制的溶液应尽可能用0.1的 DEPC,在37?处理12h以上,然后用高压灭菌除去 残留的DEPC;不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC [收稿日期]2009—04—22;2009—06—2O修回 [基金项目]国家自然科学基金项目"云南水稻地方品种稻瘟病菌信号分子关键受 体及其在互作中的作用"(30860161) [作者简介]陈名红(1974一),男,副教授,在读博士,研究方向:分子植物病理学. *通讯作者.Email:ILchengyun@gmail.corn 第8期陈名红等用半定量RT-PCR法分析基因表达水平的影响因素?29? 处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22m滤膜过 滤除菌;设置RNA操作专用实验室,所有器械等应 为专用.要注意DEPC是剧毒物质,有致癌作用, 因而在使用时要特Nd,心. 1.2组织总RNA的提取 从组织提取总RNA的方法很多,如常采用的 有异硫氢酸胍法,CTAB法及总RNA提取试剂盒 )等,目前总RNA提取试剂盒应用较为 (Trizol法 广泛.总RNA提取试剂盒是许多公司根据RNA 提取的需要专门研制的,研究者可根据需要进行选 择.一般按照试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作,可快速有效地提 取到高质量的总RNA.使用试剂盒对植物组织总 RNA提取的优点,一是在于质量保证,提取速度快, 使用方便,效率高,根据不同组织用总RNA提取试 剂盒一般可以提到总RNA的5O%以上;二是在提 取试剂中一般含有抑制RNase的活性的成分,提取 所得的总RNA无蛋白和DNA污染.要注意在整 个RNA提取过程中都必须在低温下或冰上进行, 提取所得的RNA应立即贮存在一80?冰箱或液氮 中保存. 1.3总RNA的纯度和完整性鉴定 总RNA的纯度和完整性关系到后面的cDNA 合成及PCR扩增.因此,所提的总RNA要求纯度 高,完整性好并达到一定的浓度.总RNA提取之 后,必须用紫外分光光度计测定其纯度和浓度,当其 吸光度值A:./A...在1.8,2.0时,说明纯度较高, 符合实验要求.然后再在19,5左右的普通琼脂糖凝 胶上分离总RNA以鉴定其完整性,完整的RNA在 琼脂糖凝胶电泳时可见两条主带(小分子量的 tRNA也可形成一条带,但常不明显).主带明亮, 清晰,条带锐利(指条带的边缘清晰),分子量较大的 为28SrRNA,分子量较小的为18SrRNA,其余弥散 者为tuRNA.RNA未降解时,泳道上28SrRNA的 亮度为18SrRNA的2倍,小于2倍则说明RNA有 明显降解.浓度不高,完整性不好的标本最好不用, 以免影响后面的实验结果[6]. 2cDNA第一链的合成 由总RNA逆转录成cDNA第一链时,除了要 求有高质量的总RNA以外,在逆转录之前,作为起 始模板各个样品中的总RNA量也要一样多,而且 最好都在1g以上,这样才能保证PCR扩增产物 能真实反映各个样品间基因表达的差异.因此,在 进行逆转录之前研究者必须对所提取的总RNA浓 度进行调整,使所要进行逆转录的RNA稀释到相 同浓度,然后再进行逆转录.逆转录酶AMV或 MMLV能有效地逆转录RNA,合成模板cDNA,加 RNasin(RNA酶抑制剂),可获得最高产量.实验 证明,cDNA合成后残留的完整tuRNA模板干扰 RT-PCR,因为它与cDNA竞争作为PCR模板Lg], 而AMV和MMLV逆转录酶的内在RNaseH活性 足以降解残的大多数mRNA模板.但使用缺乏 RNaseH活性的逆转录酶时,则必须用RNaseH处 理cDNA.对于刚开始做逆转录实验的研究者,为 增加实验成功的几率,顺利地从组织细胞提取的总 RNA通过逆转录获得高质量的cDNA第一链,建 议使用逆转录试剂盒来进行逆转录实验.逆转录试 剂盒的获得比较容易,目前许多生物技术公司都有 现成的逆转录试剂盒出售,研究者只需按照试剂盒 说明书操作即可,方便快捷,可靠性强. 3PCR扩增反应 PCR扩增是以逆转录的cDNA第一链为模板, 以特异性引物扩增所要检测的mRNA.利用半定 量RT—PCR法对mRNA进行分析,最关键的就是 要优化各步实验条件,以构建最佳的PCR扩增反应 体系. 3.1引物的设计及选择 PCR反应的特异性是由.一对上下游引物所决 定的.引物的好坏往往是PCR反应成败的关键. 引物包括扩增目的基因的引物和扩增内参基因的引 物.为保证PCR扩增的特异性,引物的设计要根据 基因的非保守序列设计.目的基因和内参基因引物 的预期退火温度应尽量相符.引物序列进行比对 时,二者应无同源性,而且目的基因与内参基因的扩 增产物长度应有一定差异(最少200bp以上),以免 电泳时重叠,不利于观测结果及密度扫描.在选择 PCR引物时,尽量使上游和下游引物跨越不同外显 子,这样能把从cDNA得到的扩增产物和从可能污 染的包含内含子序列的基因组DNA得到的扩增产 物区分开.应选择扩增长度为400,2000bp产物 的引物,因为小于400bp的扩增产物需要高分辨率 的特殊琼脂糖凝胶区分;大于2000bp的产物受酶 作用性能等因素的限制,难以得到有效扩增.此外, 引物序列与其它转录基因完全同源时,会产生更多 的伪假PCR产物,因此要经多次筛选,才能最终确 定最适引物. 3.2内参的选择 为避免RNA抽提,加样,测量,cDNA合成及 PCR反应过程中的某些系统误差和人为误差,用半 定量RT-PCR分析基因mRNA相对表达水平时必 须要引入内对照系统即内参[8].内参一般为管家基 因(house-keepinggene),又称看家基因,持家基因, 是维持细胞最低限度功能所不可少的基因.这类基 因在所有类型的细胞中都进行表达,因为这些基因 的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不 可少的.管家基因表达水平受环境因素影响较小, 而且在个体各个生长阶段的大多数,或几乎全部组 织中持续表达,或变化很小.它的表达只受启动序 列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响,而不 贵州农业科学 受其他机制调节.传统的半定量RT—PCR技术多 以~]-actin作内参;另外,常用的内参照还有GAP— DH,B—MG,18SrRNA等.不同的生物体其生命过 程和生理过程各不相同,选用何种内参要根据目的 基因和实验的具体情况而定.为保证实验结果的可 信度,每一次实验都必须做内参,要注意内参扩增产 物的大小最好与目的基因mRNA扩增产物的大小 相差200bp以上,这样便于结果的观测. 3.3同管扩增或异管扩增的选择 利用半定量RT-PCR技术对mRNA进行检测 时一般要将内参基因和目的基因在同管中或异管中 进行扩增.同管扩增是指内参基因和目的基因在同 一 个管内进行扩增.异管扩增是指将二者分开来扩 增.同管扩增可以保证目的基因和内参基因的反应 条件完全一样,与异管扩增相比较,具有样品问的可 比性强,系统误差小,操作方便等优点.但PCR扩 增存在平台效应,内参基因表达水平往往很高,目的 基因的表达水平相对较低.在进行PCR扩增时,常 常是目的基因还在线性期,内参基因已经达到平台 期.这样在进行同管扩增时,目的基因就会由于内 参基因的竞争而受到抑制,从而降低扩增效率并最 终影响结果的分析.与同管扩增相比较,异管扩增 具有保证每个基因的扩增进程优化的优点,但又存 在扩增效率不能保证一致的缺点.因此,在实验中 研究者要根据实际情况和需要进行选择. 3.4PCR循环数的确定 PCR扩增反应是酶促反应,遵循酶促动力学原 理,开始的循环内扩增产物呈指数累积,产物与模板 呈线性关系.半定量RT-PCR技术正是利用产物 与模板量的这一线性关系,通过扩增产物来对比总 RNA中目的基因的表达E4-s].但经过一定的循环 后,PCR产物不再呈指数累积而进入平台期,即产 物的浓度不再增加.PCR反应达到平台期的时间 主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和 扩增效率.起始模板量越多到达平台期的时间就越 短,扩增效率越高到达平台期的时间也越短.如果 在平台期继续扩增,则低水平表达的目的RNA可 能会增加,并与高水平表达的目的RNA浓度相近. 这样就掩盖了它们之间本来存在的丰度差异.因 此,选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖 凝胶上清晰可见和定量,也可使扩增反应在到达平 台期前的线性范围内进行.故,为避免平台效应的 影响,合适的循环数是PCR半定量方法的关键因素 之一L1...一般来说,可以先分别做25,28,3O,32及 34个循环,当看到条带逐渐变亮后,我们选用中间 亮度做为最后循环数.实验中可以根据目的基因的 表达强弱,适当增加或减少循环次数. 3.5其他因素 除了上述所提到的几种关键因素外,Mg浓 度,反应缓冲液成分,dNTPs,引物,模板cDNA浓 度等因素对PCR扩增的特异性和产量都有显着的 影响.Mg.浓度是影响Taq酶扩增效率的重要因 素,它还可影响引物的退火和解链温度,影响产物的 特异性以及引物二聚体的形成等.Mg.浓度过高 则反应特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低会 降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少.试 验过程中可分别取1.0,1.5,2.0mM/LMg.进行 预试验,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,通过鉴定 其亮度和特异性来确定最适的M浓度.此外, 研究者还要相应的调整dNTP,Taq酶浓度等其他 的一些参数来提高反应的特异性及灵敏度,最大限 度地提高半定量RT-PCR技术的可靠性. 4结果与分析 半定量PCR技术是依靠对电泳图片的灰度扫 描来实现的.为鉴定PCR扩增产物是否与预期的 结果一致,通常采用标准Marker比较法.具体做 法:先根据扩增产物片段的大小配制最适宜浓度的 琼脂糖凝胶,将PCR扩增产物进行凝胶电泳,电泳 结束后再经溴化乙锭染色,最后在凝胶成像系统下 拍照和定量分析(一般测定电泳条带的IOD值,目 的基因相对表达量为其电泳条带的IOD值与内参 基因的电泳条带的IOD值的比值,然后对数据进行 统计分析),并最终作出结论.电泳时,所选用的 Marker应尽量含有与扩增产物相对应的条带.为 了使扩增条带密度扫描的峰面积积分值尽量的准确 可靠,电泳条带一定要清晰,不能有杂带出现.有杂 带出现的标本最好不用,若有杂带应重新调整PCR 过程中的循环次数和退火温度,直至杂带消失,这样 才能保证扫描结果的专一性及可靠性. 5结束语 用半定量RT—PCR法分析基因表达水平是一 项系统而复杂的工程,研究者在进行相关研究时,除 了积极查阅资料,参考有关文献提供的线索以外,还 要充分考虑所在实验室的条件和综合分析各种影响 因素,从提取组织样品开始到最后结果的统计分析, 实验的每一步都要严格认真操作,从而确保半定量 RT—PCR法分析基因表达水平结果的准确性和可靠 性.半定量RT-PCR法是一种粗略地估计基因表 达的相对变化的方法,它存在一些自身缺点.诸如 对于表达较低的基因,电泳易看不到目的条带,误判 为基因缺失;加样误差,也影响相应的测量结果;非 同管扩增,难以保证扩增效率一致等等,因此它并不 能准确测定不同样品间基因表达相差的倍数,若要 精确地分析基因表达的差异还需利用荧光实时定量 PCR等技术[1.但实际上多数研究的焦点并不是 检测转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是 检测其表达水平变化是否显着(至少增加或减少1.2 倍以上)[6].所以,尽管目前已发展了一些能够准确 (下转第33页) 第8期郭治友等都匀龙胆草的组织培养与快速繁殖技术?33? 1 2* 3 4 5 0 0 O.5 1.0 1.5 0 0 0.2 0.2 0.2 O 3.0 O O 0 24 23 2O 25 24 一 般,2,3 一 般,2,5 较多,4,8 少,1,2 无 瘦弱且短.长势好 瘦弱且短,长势良好 较粗壮且发达,长势较好 较1号,2号瘦弱.且短,长势弱 注:未标*的基本堵养基为MS,标有*的基本堵养基是1/2MS. 3讨论 1)在外殖体诱导愈伤组织时,首次发现冬季采 的幼茎和成熟的茎段培养出现了褐化现象,其他的 外殖体均未出现这一现象,添加AC可以得到有效 抑制,这可能是因外殖体不同季节的生理状态不同 而引起的褐化现象[4]. 2)龙胆草的愈伤组织诱导,有利于采用组织培 养的方式,得到大量的愈伤组织,为进一步分析不同 培养基的培养下对龙胆草愈伤组织所含有效成分的 影响奠定基础,也为得到工厂化生产龙胆草细胞组 织原料奠定基础. 3)在培养中发现,龙胆草的茎分枝能力较强, 所以在丛生芽的诱导时,直接采用外殖体诱导丛生 芽,增殖系数较高,不采用愈伤组织来诱导丛生芽分 化的途径,从而节省了培养时间和成本. 4)在龙胆草生根培养过程中,在低浓度的生长 素和细胞分裂素,低有机物质的培养基上和添加 AC均能促进丛生芽生根诱导,所以通过离体快繁 的方式培育龙胆草种苗,方法可行,成本较低. 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