重组葡激酶的分离纯化
李 倩 荫 俊 付 玲 李广善 宋 伟 李成文 徐秀芝
()军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071
摘要 在构建出高
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达 、高活性的葡激酶工程菌株的基础上 ,对表达产物进行了分离纯化研究 。经 离子交换纯化后 ,纯度达 85 %,90 % ,回收率为 50 %,60 % ,经凝胶过滤后 ,纯度达 99 %以上 ,回收
3 5 率为 60 % ,经 SDSΟPAGE 测定 ,相对分子质量为 15 . 5 ×10,比活为 1 . 0 ×10,N 端氨基酸序列与文献 报道的相符 。
关键词 重组葡激酶 ;蛋白 ;纯化
Isolation and purif ication of recombinant sta phylokina se
Li Qian , Yin J un , Fu Ling , Li Guangshan , Song Wei , Li Chengwen , Xu Xiuzhi
( )Institute of Microbiology and Epidemiology , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100071 Abstract The purification of recombinant staphylokinase was studied on the basis of the construction of the high expression engineering bacterium. After a step of ion exchange chromatography ,its purity is 85 %,80 % by SDSΟPAGE and the recoveries of proteins were 50 %,60 % ; after a step of gel filtration , which purity was over 99 % by HPLC measurement . The apparent molecular weight is 15 . 5 kD and the specific activity is 6 . 7 45 ×10,1 . 0 ×10U/ mg.
Key words recombinant staphylokinase ; protein ; purification
( ) 葡激酶 SAK与链激酶都是细菌产生的纤溶酶 1 . 2 培养基
原激活剂 。与链激酶不同的是 ,葡激酶溶解血栓具 LB 培养基含酵母抽提物 5 g/ L ,蛋白胨 10 g/ L , 有特异性 :当有血栓存在时 ,葡激酶激活纤溶酶原变 NaCl 5 g/ L ,p H7 . 0 。固体 LB 培养基含琼脂粉 12 g/ α成活性纤溶酶 ;而当血栓溶解后没有血栓时 , 抗纤 2 L ,其余同 LB 培养基 。溶酶与纤溶酶形成无活性的复合物 ,葡激酶与纤溶 1 ,2 1 . 3 仪器酶解离 ,处于一种抑制状态。所以 ,葡激酶是一
3 ,5 ( ) ( QΟSepharose 离 子 交 换 柱 3 . 3 cm ×21 cm自 种有潜力的纤溶酶原激活剂。由于重组葡激酶 6 ,7 ) ) ( 装,填料为 QΟSepharose FF Pharmacia 公司产品;分 一般是以可溶状态存在于胞浆内, 所以纯化步
( ) ) ( 子筛 色 谱 柱 3 . 7 cm ×100 cm自 装 , 填 料 为骤复杂 ,需要液相色谱仪这样昂贵的设备 。我们采
) ( 用了自行装柱的办法 ,摸索出简单易行的纯化工艺 。 Sephacryl SΟ100 Pharmacia 公司产品。紫外检测仪 、
经离子 交 换 和 凝 胶 过 滤 两 步 法 纯 化 后 , 纯 度 达 到 小型台式
记录
混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载
仪均为 Pharmacia 公司产品 。KSΟ600
99 %以上 ,为中试放大打下良好的基础 。超声波细胞粉碎机为中国宁波经济技术开发区科生
仪器厂产品 。
1 . 4 工程菌发酵与葡激酶高效表达
1 . 4 . 1 工程菌活化
1 材料和
方法
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从含氨苄青霉素的 LB 平 板 上 挑 取 单 —菌 落 ,
接种于 10 ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中 ,150 r/
1 . 1 菌种 min 振荡培养 ,30 ?培养 15 h ,得活化菌液 。
pBVΟSAK 工 程 菌 株 由 李 倩 等 构 建 , 保 存 于1 . 4 . 2 葡激酶的高效表达
Ο80 ?,15 %甘油中 。将活化菌液按 1 : 100 接种于含氨 苄 青 霉 素 的
50 %,60 % 。 收率为 LB 培养基中 ,30 ?,150 r/ min 振荡培养至 D为0 . 6 600
,0 . 8 ,升温至 42 ?继续培养 4 h ,离心收集菌体 ,置
Ο20 ?冰箱保存备用 。
1 . 5 细菌破碎及离心
取出冻存于Ο20 ?的湿菌体 ,用 10 mmol/ L TrisΟ
() HCl p H8 . 0缓冲液悬浮 ,每克湿菌加入 10 ml 缓冲
液 ,混匀 ,菌液放冰浴超声破碎 15 min ,12 000 r/ min
离心 60 min ,收集上清 ,沉淀物用以上缓冲液悬浮后
再置冰浴超声破碎 ,离心收集上清 。
1 . 6 离子交换柱层析
() 层析柱用 10 mmol/ L TrisΟHCl p H8. 0平衡后 ,超
声破碎收集的上清 ,用 10 mmol/ L TrisΟHCl 缓冲液稀
释至 1,2 mg/ ml 后上层析柱 。上样结束后 ,用 3 倍柱 SDSΟPAGE
分析
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离子交换各组分 图 1
床体积的上述缓冲液洗脱未结合蛋白 ,洗脱峰恢复至
基线后 ,用 0. 5 mol/ L NaClΟ10 mmol/ L TrisΟHCl 洗脱 ,
收集洗脱峰各组分并测定各组分 SAK 活性及蛋白浓
度 ,SDSΟPAGE 分析各组分中 SAK 含量 。
1 . 7 凝胶过滤
分子筛凝胶柱用 0 . 02 mol/ L 磷酸缓冲液平衡备
用 。将离子交换柱收集的活性组分合并 ,加入固体
硫酸铵 ,使饱和度达 90 % ,4 ?静置过夜 , 离心后留
沉淀 ,沉淀用 0 . 02 mol/ L 磷酸盐缓冲液复溶 ,离心 ,
上清液上凝胶柱 ,检测仪和记录仪检测蛋白峰 ,用纤
维蛋白溶解法测定各组分中 rSAK 活性 ,收集活性主
峰 ,用 SDSΟPAGE 初步测定 rSAK 纯度 。
1 . 8 rSAK 测定
采用高效液相反相色谱法测定纯度 。采用纤维
6 蛋白溶解法测定活性和比活 。
1 . 9 N 端氨基酸序列测定分析 图 2 离子柱纯化后样品电泳薄层扫描图
采用 Edman 降解测序法 。
2 . 3 凝胶过滤
经离子柱纯化的 rSAK 用硫酸铵沉淀复溶后 ,通 2 结果 过 Sephacryl SΟ100 柱 。SDSΟPAGE 分析如图 3 。高效
液相反相色谱法测纯度达 99 %以上 ,见图 4 。2 . 1 工程菌发酵与高效表达 比活测定rSAK 2 . 4
5 发酵后的工程菌经 SDSΟPAGE 鉴定 , SAK 基因 用纤维蛋白溶解法测得 rSAK 比活为 1 . 0 ×10。3 表达相对分子质量为 15 . 5 ×10,与理论值相符 ,表 2 . 5 N 端氨基酸序列分析 达水平经薄层扫描仪扫描 ,目的蛋白占菌体蛋白的 用 Edman 降解测序法测得 rSAK N 端氨基酸序
60 %,70 % 。列为 SerΟSerΟSerΟPheΟAspΟLysΟGlyΟLysΟTyrΟLysΟLysΟGlyΟ
7 2 . 2 离子交换柱层析 AspΟAspΟAla ,该序列与文献报道的相符。
超声破碎离心上清上 QΟSepharose FF 柱 ,色谱仪
控制流速和检测蛋白峰 。上样后洗脱未结合的蛋白 3 讨论 至基线后 ,用 0 . 5 mol/ L NaClΟ10 mmol/ L TrisΟHCl 洗
脱 ,rSAK 出现在洗脱主峰 。SDSΟPAGE 及薄层扫描 有关重组葡激酶纯化工艺的报道 , 目前国内外 结果见图 1 和图 2 。rSAK 纯度达到 85 %,90 % ,回
的的纯化工艺研究 。Schlott 介绍的纯化方法 ,工程菌
裂解后 ,45 000 g 离心 30 min ,经离子交换 、疏水色谱
后 ,还要经过 Sephacryl SΟ300 分子筛 ,纯化步骤复杂 ,
7 费用较高。上海医科大学对葡激酶的纯化有了改
进 ,工程菌破碎后离心上清经两次硫酸铵沉淀后 ,经
凝胶过滤 ,离子交换层析 ,纯度可达 98 % ,步骤减化 ,
9 但设备条件要求较高 ,需要液相色谱仪。我们利用
现有的实验条件 ,自装离子交换柱和凝胶柱 ,工程菌
破碎离心上清经一次硫酸铵沉淀 ,经离子交换和凝胶 柱两步纯化后 ,重组葡激酶纯度达 99 %以上 。步骤简 SDSΟPAGE 分析凝胶过滤各组分 图 3 含杂蛋白带为细菌表达产物 单 ,易重复放大 ,为中试打下良好的基础 。
图 4 高效液相色谱法测 rSAK 纯度色谱图
5 Vanderschueren S , Stockx L , Wilms G et al . Thrombolytic therapy of 参考文献 peripheral arterial occlusion with recombinant staphylokinas. Circulation ,
1995 ,92 :2050 2 1 Collen D , Schlott B. On the mechanism of the activation of human plas 6 宋后燕. 一种重组葡激酶的制备方法. 中国专利 ,941121050 . 4minogen by recombinant staphy lokinase . J Biol Chem , 1993 ,268 :8284 Schlott B , Hartmann M , Guhrs KH et al . High yield production and pu2 7 2 Silence K , Collen D , Lijnen HR et al . requlation by alpha 2Οantiplasmin rification of recombinant staphylokinase for thrombolytic therapy. Bio/ and fibrin of the activation of plasminogen with recombinant staphy loki2 Technology ,1994 ,12 :185 nase in plasma . Blood 1993 ,82 :1175 8 Stowers AW , Spring KJ , Saul A. Preparative scale purification of recom2 3 Collen D , Van WF. Coronary thrombolysis with recombinant staphyloki2 binant protein to clinical grade by isotachophoresis. Biothchnology ,1995 , nase in patients with evolving myocardial infarction. Circulation , 1993 , 13 :1498 87 :1850 于敏 ,张小旋 ,任军等. 注射用重组葡激酶的中试研究. 高技术通 9 4 Collen D. FibrinΟselective thrombolytic therapy for acute myocardial in2 讯 ,1998 ,1 :45 farction. Circulation ,1995 ,93 :857 () 1999Ο06Ο18 收稿