大黄素和rhTGF-β1联合诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

大黄素和rhTGF-β1联合诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 大黄素和rhTGF-β1联合诱导人骨髓间充 质干细胞向成骨细胞分化 医学创新2010年4月第7卷第12期Medical!塑!::!: 大黄素和rhTGF—I31联 干细胞向成骨细胞分化 赛音其木格 合诱导人骨髓问充质 【摘要】目的探讨不同的方法对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的影响.方法采用不同方法诱 导第三代人骨髓MSCs向成骨细胞分化,对照组:采用基础诱导培养液:地塞米松(10mol/L),B一甘油磷酸钠 (10mmol/L),L一抗坏血酸(5Og/L);大黄素组:基础诱导培养+大黄素(10molZL);大黄素rhTGF一131组:基础 诱导培养液+大黄素(10tooL/L)+重组人转化生长因子一81(recombinanthumantransforminggrowthfactor—betal, rhTGF一131)5ag/ml.结果大黄素和rhTGF—B1对人骨髓MSCs增殖的影响:对照组和大黄素组与大黄素+ rhTGF一131组比较均具有显着差异(P<0.05).大黄素和rhTGF一131对人骨髓MSCs分化的影响:对照组,大黄素组 与大黄素+rhTGF一131组比较均具有显着差异(P<0.叭).结论基础诱导培养液加rhTGF一1315ng/ml和大黄素 (10mol/L是理想的具有f临床实用价值的成人骨髓MSC体外诱导为成骨细胞的培养体系. 【关键词】大黄素;rhTGF一131;问充质干细胞 Differentiationofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsintoosteoblastinducedbye modinandrhTGF—p1 Sai—yin—qi—mu— ge.EerduosiCentralHospital,InnerMongolia,Dongsheng017000,China 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheeffectsofemodinonthedifferentiationofhumanbonemarrowmesenchymal stemcells(MSCs)intoosteoblastinvitro.MethodsDifferentmethodswereusedtoinducethethird—passageMSCstodif- ferentiateintoosteoblastinvitro.Controlgroup:dexamethasone+B—glycerophosphate+L —ascorbicacid;emodingroup: dexamethasone+一glycerophosphate+L—ascorbicacid+emodin;emodin+rhTGF一 131group:dexamethasone+B— glyeerophosphate+L—ascorbicacid+emodin+TGF一131.ResultsEmodinandrhTGF 一131ontheproliferationofMSCs hadnocomparedwithemodin+rhTGF一 13Igroup.thereweresignificantdifferencesinControlgroupandemodin+ rhTGF一 131group,respectively(P<0.05).EmodinonthedifferentiationofMSCshadnocomparedwithemodin+rh TGF一 131group,bothControlgroupandemodingroup,hadsignificantdifferences.ConclusionThebasicinductionmedi- amcombinedtheEmodinandrhTGF一 131wasthemorevalidcultureenvironmentonthedifferentiationoftheadulthuman bonema~owMSCtoosteoblastinvitro. 【Keywords】Emodin;rhTGF一131;Mesenchymalstemceils 人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是 骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干 细胞,在体内外特定条件下可向成骨,软骨,神经,肌肉等多 种类型的成熟细胞分化…,由于人骨髓MSCs的含量相对丰 富,具有取材容易,体外增殖能力强,可分化为不同类型的成 熟细胞而用于多种疾病治疗等特点,可以避免胚胎干细胞和 异基因干细胞治疗的伦理和免疫排斥等问题,因此在临床治 疗和人体生物组织工程研究方面比其他来源的干细胞更有 优势,可能成为多种器官功能老化,组织损伤修复,功能细胞 退行性变治疗及人体生物组织构建的理想种子细胞,是目前 公认"种子细胞"和体内外基因转移的靶细胞.为提高其成 骨效率,笔者选择合适的培养条件,以促进人骨髓MSCs分化 增殖并定向分化为成骨细胞.因此实验进一步观察不同培 养体系对人骨髓MSCs增殖与分化的影响. 作者单位:017000内蒙古鄂尔多斯市中心医院 通讯作者:赛音其木格 .. 着? 1材料与方法 1.1一般材料2例健康献髓者同意后各采4,6ml骨髓. 1.2方法 1.2.1人骨髓MSCs的分离,培养无菌条件下抽骨髓 4,6ml,马上注入离心管中(10ml离心管中准备2ml无血 清DMEM一肝素液,浓度50U/m1)将骨髓一DMEM混合液沿 管壁缓慢注入预置Percol1分离液的离心管中,骨髓与分离液 的比例为1:1,离心20min(2000r/rain),吸取中间层云雾状 细胞层置于另一离心管中,0.9%氯化钠注射液洗涤2次.把 得到的骨髓有核细胞进行培养.细胞培养条件:含1胎牛血 清的DMEM—LG培养基,细胞接种密度为3.0×10cells/ml. 细胞置于37,体积分数为0.05的CO饱和湿度孵箱内培 养,接种72h后首次换液去除未贴壁细胞.以后三四天换液 一 次.原代细胞汇合后用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化细 胞,按1:1比例进行传代接种培养. 1.2.2人骨髓MSCs的鉴定(1)观察形态学:用倒置光学 ? 6?医学创新2010年4月第7卷第12期 MedieMInnov~ionofChina.Aofil.2010.V01.7No.12 显微镜观察人骨髓MSCs在原代及传代过程中的细胞形态及 生长情况.(2)流式细胞仪 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 法:取第三代人骨髓MSCs用 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化收获细胞,至少2×10 个细胞与抗CD29,CD44,CD34,CD45,HLA—DR单克隆抗体 室温下反应30min,PBS洗涤2次,后与FITC标记的二抗避 光反应15min,细胞洗涤后悬浮于PBS中,用流式细胞仪检 测MSCs表面是否有上述分子的表达. 1.2.3人骨髓MSCs向成骨细胞的诱导分化取生长良好 的第3代人骨髓MSCs,消化后调整细胞数量为3.5×103/ 孔,接种于96孔培养板,置于37?,体积分数为0.05的CO 饱和湿度孵箱内培养,24h细胞大部分贴壁,吸取原培养基. 每组4孔,每孔200l,对照组采用基础诱导培养 分为3组, 液:地塞米松(10mol/L),8一甘油磷酸钠(10mmol/L),L一 抗坏血酸培养(50g/L);大黄素组采用基础诱导培养液+大 黄素(10moFL)培养;大黄素+卅rGF—Bl组:采用基础诱 导培养液+大黄素(10mol/L)+rhTGF—Bl(5ng/m1)培 养.每三四天换液1次. 1.2.4鉴定成骨细胞(1)形态学观察:细胞形态及生长情 况用倒置光学显微镜观察.(2)四甲基偶氮唑盐(Mqq")比色 法测定人骨髓MSCs增殖能力传代培养于96孔培养板的三 组细胞于第4,8,12,16天,在各孑L中加入MTr20l,置37? 孵箱内培养4h,加入10%DMSO150l终止反应,用酶联免 疫检测仪测定各孔在570nm波长的吸光度A值,计算4孔A 值的平均数.(3)测细胞总蛋白质及细胞内ALP活性:传代 培养于96孔培养板的三组细胞于第4,812,16天,在各孔中 加入2%TftonX一100150l,4?冰箱过夜,裂解细胞,分别 取50l测细胞总蛋白质及细胞内ALP活性.最后计算每克 蛋白质的ALP活性. 1.3统计学处理所有数据用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(?s)表示, 使用SPSS13.0统计软件对数据进行重复测量资料的方差分 析,不同组之间两两比较采用SNK法,试验组与对照组之间 比较采用Dunnettt检验. 2结果 2.1人骨髓MSCs的形态学特征 2.1.1倒置光学显微镜观察经Percol1分离液分离后培养 的骨髓单个核细胞,大部分于48h内即贴壁.细胞呈圆形有 小的胞浆突起,72h后大多数细胞有胞浆突起,残留的各种 类型的血细胞5d后通过完全换液逐渐除去,1周左右以长 梭形细胞为主,胞浆丰富,核大,核染色质细,核仁明显,培养 至12—14d细胞出现90%融合,呈成纤维细胞样形态,胰蛋 白酶消化传代的细胞于24h内完全贴壁,形态与原代细胞相 似,人骨髓MSCs增殖迅速,7d左右达到融合. 2.1.2流式细胞结果CD34,CD45,HLA—DR表达为阴性 CD29,CD44表达为阳性. 2.2成骨细胞的形态学特征倒置光学显微镜观察:对照 组,大黄素组,大黄素+rhTGF—B1组诱导培养后,对照组细 胞增殖速度略低.大黄素组,大黄素+rhTGF—B1组的细胞 增殖速度较快.三组细胞均有数个突起,突起的个数及形态 各不相同.诱导培养5,7d后细胞汇合成单层,细胞突起互 相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象,重 叠生长的细胞逐渐形成细胞结节. 2.3大黄素+rhTGF—B1培养体系对人骨髓MSCs增殖及 分化的影响,详见表1. 2.4大黄素+rhTGF—Bl培养体系对人骨髓MSCs分化的 影响,详见表2. 表1M1Tr法测定大黄素+rhTGF—B1培养体系对MSCs增殖的影响(A值)(? 5,n=4) 注:与对照组比较,P>0.05,P<0.05,与大黄素组比较P<O.05 表2大黄素+rhTGF—B1培养体系对MSCs碱性磷酸酶活性的影响(1000U/gprotein)(?s,n=4) 注:与对照组比较,P<0.05,P<0.01;与大黄素组比较P<0.01 3讨论, 人骨髓MSCs研究是当今生物医学的热门课题,近年来 随着医疗技术的快速发展,人骨髓MSCs被广泛地用于基础 研究和临床诊治.包括组织再生和修复,基因治疗,细胞治 疗等方面有广阔的应用前景. 人骨髓MSCs分离方法有:密度梯度离心法,贴壁分离筛 选法,流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法.本实验结合淋 巴细胞密度梯度离心法和贴壁筛选法来分离获取相对较高 细胞 纯度的人骨髓MSCs.本实验通过流式细胞分析显示,表达骨髓MSCs相对特异性抗原CD44和CD29,而CD34, CD45,HLA—DR阴性,本实验所得结果与Meirelles等报道 的骨髓MSCs表面标志CD29,CD44,CD166,CD105等阳性, 不表达CD34,CD45,CD11a,CD14等相似,证明所分离培养扩 增的细胞确为骨髓MSCs. 医学创新2010年4月盘卷第_cal旦!塑巳:Q:!: 体外培养骨髓MSCs使其增殖并向成骨细胞分化,主要 依赖于一定的培养条件.因此控制好培养条件就成为体外 诱导分化为成骨细胞的关键.本实验分别采用基础诱导培 养液,基础诱导培养液+大黄素(10mol/L),基础诱导培养 液+大黄素(10molfL)+rhTGF—t31(5ng/m1)等不同培 养体系诱导人骨髓MSCs,比较不同条件对人骨髓MSCs向成 骨细胞分化的影响.结果显示:用基础诱导培养液加大黄素 和rhTGF一131培养体系培养的人骨髓MSCs的增殖作用与其 他两个培养体系培养的人骨髓MSCs比较均有显着差异.基 础诱导培养液加大黄素和rhTGF一[31培养体系培养的人骨 髓MSCs的碱性磷酸酶活性与其他两个培养体系培养的人骨 髓MSCs比较均有显着差异.综上所述,基础诱导培养液加 rhTGF—B(15ng/m1)和大黄素(10mol/L)培养体系是比 应 患 ? 一7? 较好的成人骨髓MSCs体外诱导为成骨细胞的培养体系. 参考文献 [1]GroveJE,BrusciaE,KrauseDS.Plasticityofboneman~w—derived stemceils.StemCells,2004,22(4):487—500. [2]M~umdarMK,ThiedeMA,MoscaJD,eta1.Phenotypicandfunc— tionalcomparisonofculturesofmarrow—derivedmesenchymalstem cells(MSCs)andstromalcells.JCellPhysiol,1998,176:57—66. [3]CoherDC,ClassR,DiGirolamoCM,eta1.Rapidexpansionofrecy- clingstemcellsinculturesofplastic—adherentcellsfromhuman bonemarrow.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(7):3213—3218. (收稿日期:2009—12—29) (本文编辑:段淑娟) 用聚合酶链反应探讨丙肝病毒在胆石症 者胆囊组织中的表达 王德俊袁小芳朱兰英刘岚 【摘要】目的探讨感染丙肝病毒在胆石症患者胆囊组织中的表达.方法应用聚合酶链式反应技术 (PCR),对32例慢性丙肝伴胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本进行HCV—RNA检测.结果32例慢性丙肝伴胆石症 患者的胆囊标本HCV—RNA阳性检出率为40.63%,20例非胆石症患者的胆囊标 本HCV—DNA阳性检出率为 15%.结论提示丙肝病毒可在胆石症患者胆囊组织中表达,用PCR技术检测石蜡包 埋的HCV—RNA是一种简 便,可靠的方法. 【关键词】胆石症;肝炎病毒;丙型;聚合酶链反应 PCRindetectingthecorrelationbetweeninfectionofHCVandcholelithiasisWANGDe— jnn,YUANXiao一丘, ZHULan一 ng,LIULan.BaoanTraditionalChineseMedicineHospital,Shenzhen518133,China 【Abstract】 0bjectiveTostudythecorrelationbetweeneholelithiasisandtheinfectionofHCV.Methods32for- malin—fixedandparaffin— embeddedgallbladdersamplesofeholelithiasispatientsand2Ogallbladdersamplesofnoneholeli— thiasispatientswereinvestigatedusingthepolymerasechainreaction— Ethidiumbromide(PCR—RT)assay.The52patients werepositivetoHCVserologic//larke/'s.ResultsTheresultsshowedthatHCV— RNAwasfoundin13gallbladdersamplesof 32eholelithiasispatients(40.63%),significantlyhigherthanthatin3gallbladdersamplesof20noncholelithiasispatients (15%).ConclusionTheinfectionofHCVandtheformationofcholelithiasisarecorrelated. 【Keywords】Commonbileductcalculi;Hepatitis;Cvirus;Polymerasechainreaction HCV感染者呈世界性分布,近来研究证实HCV感染不 但侵袭肝脏致丙肝,可侵袭体内各种肝外组织和器官,并可 通过免疫反应引起肝外组织损害,还可能并发各种与丙肝病 原学无关的疾病.HCV感染有关的肝外表现和相关性疾病 近年来在国内已有报道.HCV感染肝外表现,可能与免疫学 或与病毒对肝外组织和器官的入侵与复制有关.国内外学 作者单位:518133广东省深圳市宝安区中医院(王德俊,朱兰 英);广东省深圳市宝安区妇幼保健院(袁小芳);广东省深圳市宝安 区人民医院(刘岚) 通讯作者:王德俊 者在丙肝患者的胆汁及胆道组织中发现了丙肝病毒抗原和 HCV—RNA,为探讨丙肝病毒感染与胆石症发病原因提供了 重要线索.笔者应用聚合酶链反应技术(PCR),对笔者所在 医院52例血清丙肝标志物阳性患者的石蜡包埋胆囊组织中 的HCV—RNA进行了检测以探讨感染丙肝病毒在胆囊组织 中的表达. 1资料与方法 1.1一般资料 1.I.1标本来源收集笔者所在医院2007—2009年32例 丙肝标志物阳性胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本.32例中