【doc】SRBC膜提取物对猪PBMNC第二信使的影响

【doc】SRBC膜提取物对猪PBMNC第二信使的影响 SRBC膜提取物对猪PBMNC第二信使的影 响 1,, J/ 中华微生物学和免痤学杂志1996年7胄第15卷第d期 SRBC膜提取物对猪PBMNC 第二信使的影响 馀磕亭石镜张云郭彩云P-;7z一,z 2 摘要胰酶水解绵羊红细胞(SRBC)释放膜表面活性蛋白组分?(TRF一?),单独作用可使猪外周 血单个棱细胞(PBMNC)胞内cAMP水平升高,10g/ml浓度刺激达最高峰,由对照组0.94土 0.14pmo[/L升高到2.75+--0.25pmol/L(P<0.01).如果PBMNC事先与腺苷酸环化酶(ACa~e)抑制剂 LiC1孵育后再以TRF?或PAH刺激.cAMP增高受到抑制(P<OO1)而EDTA一2Na(一种磷酸二酯 酶PDE抑制剂)对此cAMP升高无影响.结果提示,此cAMP升高主要是通过活化ACase水解ATP生 成cAMP,而不像是抑制PDE减少cAMP降解弓f起的.TRF1I诱导猪PBMNC胞内ca浓度升高,以 100~g,/ml刺激2分钟升高最多,由对照组的242土7nmol/L升高到323土15nmol,L(尸<O.01).以EG. TA除去胞外ca卧后再以TRF?或PAH刺激,仅观察到小范围[Ca"-]j升高看来这一过程包括了刺 激胞内Ca抖释放和胞外ca抖向流两种方式.以上结果 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ,TRF-?对淋巴细胞功 能影响与细胞内第二 信使有关. 关键词绵羊红细胞旦拦环腺苷一磷酸胞内游离钙障;}=I)l耳 StudyoftheintracellulmrcAMPandCn抖 ofporlnceperipheralbloodmononueleocytesXuLutingtz JzF,Zhangr'etal-OevavlmentoyMicrobiologyandlmmunolog,In~uteof丑?鲥3ci- ec?.eAcademy?ical&,BeuiaO100005' AbstractInPBMNC.the[cAMPJilevelsinducedbyTRF一?andPHAwascomparedinthis study?There,sultsshowedthatbothofthemincreasedthe_cAMPjilevelsandtheformerreac heditspeak (2.75士0.25pmol/L)frombaselinelevel(0.g4土0.14pmol/L)when1O0~g. /mTRF一?wasadded.For furtherstudY,PBMNCincubatedwithLiC 【,anACaseinhibitor,asignifieantinhibitionofincrementof l_cAMP]i(尸<0.01)wasobserved.ContrarytotheseresultstEDTA一 2Na,aPDEinhibitor,incubatedwith PBMNCwasassayedincombinationwithTRF一? orPHA,therewasafttinsignffieantenhancementof TRF一?. /PHA— inducedincrementof-cAMP~idetected(P>0.05).MainlybyactivatingACase,TRF_? aswellasPHAinducedanincreaseofl_cAMP]ileve1.InCamobilizationexperiments,TRF 一?alonein. ducedelevationof[Ca卜]jdosedependentlyandelevatedtoitspeaklevel(323土 25nmol/L)frombaseline level(242?7nmol,L)whenIO0~g/mlofTRFr? wasadded.Removalofextrace]lularCa"withEDTA, weonlyobservedasmaliriseinLca一]jafteradditionofTRF_? orPHA.The~erecruitsindicatedthat TRF一?aswellasPHAinducedtheriseofCa.noto/llybyreleaseofstoredCa一butalsobyinfluxfrom extracelJularCa抖-Theseandpreviousresultssugge*tthatTRF-?containstheactivityofEreceptornatu— rall1gand. Keyword矗SRBCPBMNCcAMPlntracellularfreeCa 本课题受国家自然科学基金资助 作者单位;100005北京,中国医学科学院基础所中国协和 压科大学基础医学学院微免室[枯陆亭(现通信地址;100053 北京宣武医院免痤科),石镜,张云,郭彩云] : 磁 T淋巴细胞表面E受体(又称CD2)与其 配体结合后,可单独介导或与TCR联合作用激 活T细胞从而发挥重要的免疫功能.本室曾报 道完整的SRBC和SRBC膜粗提物可诱导猪 PBMNC胞内cAMP水平升高,推测是话化腺 苷酸环化酶(ACase)所致".作者在此基础上 将胰酶水解制备的SRBC膜粗提物进行部分纯 化获得纯化物组分?(Trypsin—releasedfraction nl,TRF一?),并研究了其对猪PBMNC胞内 cAMP和胞浆游离钙水平的影响,探讨了其引 起淋巴细胞活化的作用机理. 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.试剂:cAMP检测试剂盒为本室自制.l~ura2/ AM(Sigma产品).Hepessaline{1{0mmol/L.NaC1. 2mmol/LKC1.1retool/LMgC12,(1mmol/LCaC12), 10mmol/LGlucose,20mmol/LHepes,0.0S~BSA. 2.实验仪器:BACKMAN双道液体闪烁计数仪. 日立F一2000型双波长荧光分光光度计. 3.TRF-I制备与鉴定:方法参见文献[3].主要步 . 骤如下:Alsever液保存的绵羊血,用0.05mol/LPBS (pH7.15)洗涤后,取积压的SRBC以等量的0.025 胰酶水解后,经三氰乙酸沉淀去盐后得SRBC粗提物, 再以不同浓度的甲酸及甲酸盐通过DEAE-纤维素阴 离子交换层析柱进行分段洗脱后,获得具有生物活性 的组分11(TRF一?).这种分子量为66×10的蛋白质 能够抑制SRBC与PBMNC形成E玫瑰花的作用,并 能增强亚适量PHA对淋巴细胞的增殖作用. 4.PBMNC悬液棚备:抗凝猪外周血经淋巴细胞分 离液分离出单个核细胞后,以RPMI1610完全培养基 (含501J/m!青霉素,501ag/ml链霉紊和20灭活小牛 血清)配成浓度为5×10个/ml和10个/ml细胞悬 液. 5.细胞内cAMP含量的测定 (1)胞内cAMP样品制备:PBMNC(5×10'个)分 别与不同浓度TRF—I,最适剂量LtC1,EDTA一2Na及 亚适量PHA共同作用,37?刺激2分钟,以冻融法破 坏淋巴细胞,终止刺激反应,56?水浴蒸干,一20?保 存. (2)应用蛋白结合竞争法测定胞内cAMP含量,方 ?法参见文献[4]. B.细胞胞荣游离钙的刹定:10个/m!PBMNC加 入终浓度为tool/LFura一2/AM,置37?避光温育60 分钟,期间振动5,6次浈载完毕1500r/rain离心5分 钟,弃上清,沉淀细胞用大量洗藏(pH7.3含钙或 pH7.3无钙Hepe8saline一次冲洗(1500r/raint5分 钟).细胞用同一洗液悬浮,调整细胞浓度为10个/ ChinJMierol~iolImmunol,July1996,Vol16.N04 m1.用日立F一2000型双波长荧光分光光度计(激发波 长316/385nm,发射波长496nm)检测待细胞内ca抖 荧光值形成稳定基线后,加入不同的刺激剂,连续检测 细胞内Ca蚪水平变化刺激完毕加入201al0.1Tri- ton×100破膜测Rmax,再加入6013mmol/LEGTA 络台游离Ca"测Rmin. 结果 1.TRF一?对猪PBMNC胞内cAMP含量 的影响:TRF一?单独作用可引起猪PBMNC胞 内cAMP升高,从剂量变化曲线可看出,以 100~g/mlTRF一?刺激达高峰,由0.94? q.14pmol/L升高到2.75士0,25pmol/L,明显 高于对照组(P<0.01),见图l.预先加入抑制 剂量的LiCI(0.4mmol/L)与PBMNC作用5分 图1TI1F—in诱导PBMNC胞内cAMP变化的剂 量曲线 1.Influenceofvarylngd~mgesTI1F-inon theintrmeellulareAMPlevelInPBMNC 4 苫 3 呈 薹2 * 星 0晰 ed如mPHATRF—l 图2L|CI对PHA/'rRF一?诱导PBI~INC胞内 cAMP的影响 FI暑2.Theeffect口,LIC10IIP~/TRF-?in— ducedIntraeelIul-rcAMP1eveli|lPBMNC 中华微生物学和免疫学杂志1996年7月第16卷第塑 钟后,再加入PHA或TRF一?,结果两者促细 胞内cAMP水平升高的作用消失(图2).预先 加入EDTA.2Na,引起PBMNC[cAMP]i基础 值增高,再加入PHA或TRF一?则三组间胞内 cAMP升高值无显着差N(P>0.05),见图3. ?. 董2 : 皇1 妻 O 围3EDTA?2Na对PHA/TRF一?诱导PBMNC 胞内cAMP的形响 F.嚷3.Theeffect0fEDTA一2NaonPAH/TRF-? inducedintracellulmrcAMPlevelinPBMNC 2.TRF-?对猪PBMNC胞内ca水平影 观察到PBMNC胞内Ca水平增高,并且有剂 量依赖关系,以100~g/mlTRF一?刺激[ca"3i 升高最多,从对照组22士7nmol/L升高到323 士15nmol/L(P<O.01)(表1).当除去淋巴细 胞胞外钙时,TRF一?同PHA一样对淋巴细胞 [ca]i水平的刺激增高作用减小.而且PHA 再刺激释放钙与TRF一?刺激无明显差异(P> 0.05(表2). 表1TRF.I不同剂量诱导PBMNC胞内Ca变 化 Table1.InfluencevIryingdosages0fTRF一? 0n[ca3ilevelinPBMNC *ComparedwithRPMI16d0(=12) **ComparedWhhPHA=12) 响:TRF一?与猪PBMNC共同作用30秒即可 表2PHA/TRF-?诱导PBMNC储存c-件释放 Table2.TheeffectofPHA/TRF-?OiltheteleaseofstoreCainPBMNC *ComparedwithcontTol**ComparedwithTRF—I 讨论 T淋巴细胞主要通过TCR/CD3将外界抗 原信息传入细胞内,经第二信使活化蛋白激酶 系统(如:PKA,PKC,Ca/caM-PK和pTK等), 进一步触发核内一系列基因活化,最终产生免 疫因子而参与免疫应答.CD2以及其它一些表 面分子(CD28,CD55,CD59,CD11,VLA5等)参 与T细胞旁路活化途径从而发挥重要的免疫功 能.在TRF.?诱导淋巴细胞活化的基础上,本 工作进一步探讨了受体配体作用引起淋巴细胞 活化与第二信使的关系.结果表明,配体纯化物 TRF-I对猪PBMNC胞内cAMP和游离Ca 水平有升高作用,并呈剂量依赖关系.目前认 为,淋巴细胞胞内cAMP一过性增高对其活化 早期有重要意义,而在DNA合成期及细胞分裂 期cAMP持续增高抑制细胞增殖.本实验及本 室以前的结果显示SRBC膜提取物均在刺激后 的瞬间引起[cAMP]i小幅度升高,这与它们促 进PBMNC激活过程是一致的..与CD2单克 隆抗体和LFA3作用于淋巴细胞显示的 [cAMP3i剂量和时间变化曲线也是相仿的0'. 本文报告的研究结果表明,TRF一?同PHA一 样主要是通过活化ACase水解ATP引起淋巴 细胞[cAMP]i增高,而不是主要通过抑制pDE 减少胞内cAMP降解方式引起LcAMP3~升高 292 的. TRF一?刺激PBMNC胞内ca浓度的瞬 间升高,这一过程包括刺激胞内储存ca"_释放 和胞外ca内流两个过程,而且证明后者是维 持胞内ca浓度的主要原固.这和PHA等有丝 分裂原引起T细胞ca"升高的机理相类 似,而且本实验结果表明,TRF一?和PHA 刺激胞内钙释放,或许源于同一储存钙,因为 TRF一?刺激内存钙释放后.PHA再刺激不再引 起胞内ca浓度的升高.结台先前的结果, TRF?既能结合于淋巴细胞表面,阻止SRBC 与淋巴细胞表面E受体的结合,又能参与淋巴 细胞信号传递过程,进而对淋巴细胞活化与增 殖发挥一定作用.提示所获得的绵羊红细胞膜 TRF-?成分具有绵羊红细胞(E)受俸天然配I苹 的活性. 参考文献 1黄眉-张云.石镜,筝.E受体配体提取与鉴定中国免痤 ChJnJMicrqblol[mmuno1.July996.Voll6,No.4 学杂志.1980,5(3):i86 2管远志,石镜,谢步文,花环形成与淋巴细胞啊cAMP水 平的变化.中国科学B辑,1蜘1,10:128l 3绦陆亭,石镜.张云.等SRBC膜提取物_骚萁对猜PBMNC 激活作用的研竞,中国免疫学杂志1995,11(81:328 {石镜,莲钢,章翰,等.cAMP测定技木的革新.中国免瘦 学杂志.1985.1(21:39 jCarCeraAC.RJnconM.OeDndazuriMD,elalCD2[sln_in votvedmregulatingcycleAMPlevelsinTcellsEurJIm muno1.1688.【8;961. HahnWCRosensteinYlBurakottSJ.erallnte:actionof CD2w】thitsIigandl?兀phocytefunctionassociatedantJgen3 Jnflucesadenosine6'.5~eyciicmonophosphareproductionin TlymphoeytesJlmmuno1.1091.147:I4- Gelf~dEW,CbenngRKandGrinshinS-ecalMitogen—in— ducede?nantesinCa}permeab~1Jta0tmediatedby vottagegatedK十ehannelsJBioChem-1986!I:1l520- GelfanflEW-ChenngRK?MillsGB-etalUptakeofextracel lubTCa2+adnotrecruitmentominternal0Teesse~ia] forT]ympb~yteproliferaliota.EurJlmmu:lo1.】988,'8: 9】7. (收稿l99,510;8修晤:I9960108) 抗HEL抗独特型抗体制备及酶功能模拟初探 李啊远肖玉肖丽荚李虹蒋甲垡牟象琬王道若 根据Jerae的免疫网络理论.具有抗原内影像的抗 独特型抗体(AD.或AbzB)可蹦模拟抗原诱发机体产生 免疫应答,而这种模拟作用多属分子构象上的模拟.本 研究选择鸡卵清溶菌酶(HEL)作为研究模型进行了这 方面的探索 通过对制各的鼠抗HEL的单克隆抗体(McAb) 分析,发现B7,B10是针对HEL活性中心的,B8是远 离活性中心的.用这三株MeAD作免疫原分别免疫同 系BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,筛选,共藏得 71株稳定分泌Ab.的单克隆抗体(McAb.)细胞株,每 组选二株MeAb进行鉴定发现由针对HEL活性中 心的B7,B10诱生的McAbz既可与兔抗HEL结合,这 本课题受国家自然科学基盘资助 作者单位:610041华西医科大学微生物学教研室 种结合叉能被HEL抑制而且溶解具有模拟HEL溶 解溶壁微球苗(M.Lys)的活性.针对HEL活性中心外 的B8诱生的MeAD则无这二种特胜.结果印证了我 们的设想,即ADz也可进行功能模拟在针对HEL活 性中心的免疫网络中存在模拟HEL溶苗活性的Ab, 说明了Abz与^b所针对的抗原表位之间的对应关 系 ? 实验中还发现,MeAb.的模拟溶菌作用明显弱于 HEL本身,而把针对B7,B10的MeAb2混台作用于 M.Lys时,其涪菌作用就明显增强这既表明了单一的 McAb模拟作用的局限性,也表明了酶活性中心在催 化作用中相互倍桢的重要眭.对模拟Ab的实际应用 具有指导意殳. (收稿:1906—04一们修回;1996.05—23)