DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪 实验研究 中国药物与I临床2009年8月第9卷第8期 ChineseRemedies&Clinics,August2009,Vo1.9,No.8 变化的.本研究结果证实,小白菊内酯作用结肠癌HT-29细 胞后,Caspase一9 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达增加.而Caspase一9表达增加,又可能通 过直接激活Caspase一3,形成级联反应,从而促进结肠癌细胞 发生凋亡.同时.在50—200trmol/L的浓度范围内,小白菊内 酯浓度与Caspase一9表达也有一定的量效关系.我们推测,小 白菊内酯有可能是通过激活Caspase一9与Caspase一3的表达 而促进结肠癌细胞凋亡.这也可能是小白菊内酯可能抗肿瘤 机制之一.但因凋亡过程十分错综复杂,关于小白菊内酯对 凋亡的其他因子的影响有待于进一步实验. 综上所述.小白菊内酯对结肠癌HT一29细胞具有凋亡诱 导作用,其机制可能与激活Caspase一3,Caspase一9表达有关. 因此,小白菊内酯能促进肿瘤细胞凋亡,将其应用于肿瘤治 疗值得进一步研究. 参考文献 1KimJH,LiuL,LeeSO,eta1.Susceptibilityofcholangiocarcino-- macellstoparthenolide—inducedapeptosis.CancerRes,2005,65 (14):6312—632O. 2ParkJH,IjuL,KimIH,eta1.Identificationofthegenesinvolved inenhancedfenretinide-inducedapoptosisbyparthenolidein humanhepatomacells.CancerRes,2005,65(7):2804—2814. ? 703? 3KimDS,KimSY,JeongYM,eta1.Light-activatedindole一3一 aceticacidinducesapoptosising361humanmelanomacells.Biol PharmBull,2006,29(12):2404—2409. 4PetitPX,ZamzamiN,VayssiereJL,eta1.Implicationofmitochon- driainapoptosis.MolCellBiochem,1997,174(1-2):185. 5BrattonSB,MacfarlaneM,CainK,eta1.Proteincomplexesacti- vatedistinctcaspasecaseadesindeathreceptorandstressin- ducedapoptosis.ExpCellRes,2000,256(1):27-33. 6FriedrichK,WiederT,VonHaefenC,eta1.Overexpressionof caspase-3restoressensitivit3~fordrug-inducedapeptosisin breastcancercelllineswithacquireddrugresistance.Oncogene, 20o1.20(2):2449-2460. 7SuzukiK,HasegawaT,SakamotoC,eta1.Cleavageofmitogen— activatedproteinkinasesinhumanneutrophilsundergoingapop— tosis:roleindecreasedresponsivenesstoinflammatorycytokines.J Immunol,2001,166(2):1185-1192. 8SleeEA,HarteMT,KluckRM,eta1.Orderingthecytochromec— initiatedcaspasecascade:hierarchicalactivationofcaspases-2, 一 3,一6,一7,一8,and一10inacaspasc一9一dependentmanner.J CellBiol,1999,144(2):281-292. (收稿日期:2008—1l—l1) DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究 刘伯轩刘师伟王建华樊彩兰李晶李华青岳晓华张悦红刘卓拉牛勃 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是成 体干细胞的一种.除参与构成造血微环境外,可分化为成骨, 成软骨,脂肪,胰岛,骨骼肌,肌腱样组织等结构.在组织工程 和细胞治疗方面具有广阔的应用前景.MSCs移植为糖尿病 等代谢性疾病治疗带来希望,是目前研究的热点.4,6-联脒一 2一苯基吲哚(DAPI)作为荧光染料,目前被广泛用于标记移植 细胞.然而进行中长期实验,DAPI标记效果如何,目前尚缺乏 报道.因此我们在进行MSCs移植治疗糖尿病疾病研究之前, 为评价其中远期疗效研究,有必要对DAPI标记的MSCs进行 体内外示踪实验. 1材料和方法 1.1材料 Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心),L一达氏修正 依氏培养基(DMEM)(Hyclone公司),胎牛血清(FBS,杭州四 季青生物有限公司),胰蛋白酶(Gibco公司),链脲佐菌素 (STZ,Sigma),CD44,CD45,CD71(Caltag公司),CD105(Santa 作者单位:030001太原,山西医科大学生物化学与分子生物学教 研室(刘伯轩,樊彩兰,李晶,李华青,岳晓华,张悦红,牛勃);山西医 科大学第二医院内分泌科(刘师伟);首都儿科研究所生物技术室 (王建华);山西医科大学第二医院呼吸科(刘卓拉) 通信作者:牛勃,Niub2004@126.corn Crauz),DAPI(Sigma),荧光倒置显微镜(Olympus),CO:细胞 培养箱(SIM公司),流式细胞仪(BD),离心机(Beckman). 1.2方法 1.2.12型糖尿病动物模型制备:糖尿病大鼠试验组腹腔内 注射STZ(60mg/kg)1次.对照组腹腔内注射等容积柠檬酸缓 冲液.葡萄糖氧化酶法检测大鼠血糖.血糖?16.77mmol/L稳 定2d为造模成功. 1.2.2骨髓间充质干细胞的分离,培养:颈椎脱臼断颈法处死 大鼠.75%乙醇中浸1020min,无菌状态下取出双侧股骨和 胫骨,浸泡于灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)(含100U/ml青霉素和 链霉素).暴露骨髓腔后,用L—DMEM(含20%的FBS)培养液 反复冲洗.收集骨髓细胞悬浮液,将所获的骨髓液用吸管反 复抽吸吹打成单细胞悬液并用培养液调节至适宜的细胞密 度,单个细胞悬液接种于25cmz塑料培养瓶,置于37?, 0.05%CO,饱和湿度培养箱中培养,细胞5h开始贴壁,换液 去除未贴壁细胞.培养至10d左右,90%1:2上细胞趋于融合. 经胰酶消化后1:3传代.连续传4代后MSCs获得形态均一 的MSC. 1.2.3骨髓间充质干细胞的鉴定:将第4代贴壁MSCs胰酶 消化后分别制成单细胞悬液.PBS洗涤2次,调整细胞浓度为 ? 704?中国药物与临床2009年8月第9卷第8期 ChineseRemedies&Clinics,August2009,Vo1.9,No.8 106爪/ml.取100l样品,加入CD34,CD44,CD45,CD71, CD105单抗各2O充分混匀,荧光标记的IgG作为对照组, 室温避光孵育20min,流式细胞仪检测其抗原表达.Cell— quest软件对实验结果进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 . 1.2.4骨髓间充质干细胞成骨诱导分化:5xl&个MSCs接种 于25mm培养皿.加入含l0-Tmo1]L地塞米松,10mmol/LB一 磷酸甘油,0.05mmo1]L维生素C和10%胎牛血清的L— DMDM培基,每3-4d全量换液1次,培养21d后,取出培养 皿.PBS洗涤.VonKossa染色(4%甲醛固定1h后,浸入5% 硝酸银水溶液中10rain,紫外光曝晒10min,蒸馏水洗涤,在 浸入5%硫代硫酸钠溶液中,蒸馏水洗涤;1%中性红衬染1 min,水洗.晾干,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 显微镜下观察钙化小结并照相. 1.2.5DAH标记取第4代MSCs:待细胞50%,60%融合时, 培养液中加入DAPI(终浓度50~g/m1)孵育过夜后换液,PBS 洗涤细胞至少6次,以去除未与细胞结合的DAPI. 1.2.6体外示踪实验标记MSCs的培养瓶:用铝箔纸包裹,避 光换液.按观察时点分为3组,分别于标记后ld,1周,3周 在荧光镜下观察.荧光显微镜下计数视野中DAP!阳性细胞, 同视野相差镜下计数视野中全部细胞,按标记率=DAPI阳性 细胞数,全部细胞数,计算标记率. 1.2.7经尾静脉移植MSCs:Wistar大鼠分为模型组与实验 组.实验组大鼠尾静脉注射DAPI标记的MSCs单细胞悬液 (5xl&/0.5m1).对照组注射等量PBS溶液.于移植后1周取大 鼠胰腺,肾脏,肝脏,心脏新鲜组织置于液氮中迅速冷冻,冰 冻切片机连续切片.荧光显微镜观察DAPI阳性细胞. 1.3统计学分析 数据以互表示,采用SPSS11.5统计软件对实验数据进 行分析.P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果 2.1.1培养结果:第4代骨髓间充质干细胞呈梭状,漩涡样生 长,排列紧密. 2.1.2流式细胞仪检测结果:骨髓间充质干细胞流式检测 CD44,CD71,CD105阳性,CD45阴性,符合其特征性抗原表 达:见图1. 10102103104 CD7lFlTc CD34,CD45阴性.CD44,CD71阳性 图1流式细胞仪鉴定结果 2.1-3MSCs的成骨诱导结果:可见大量钙结节黑色颗粒沉 淀. 2.2体外示踪实验 荧光镜下.DAPI标记1d的MSCs,胞核可见明亮蓝色荧 光.标记率达100%.随着时间延长,荧光逐渐进行性减弱,标 记率不断下降,1周时,少数MSCs观察不到荧光,而3周时 只有约2%MSCs可观察到标记 2.3各组织中DAH标记细胞情况 荧光镜下,移植l周组织中,可观察到实验组大鼠胰 腺,肾脏中有DAPI阳性细胞,提示MSCs能定位于胰腺,肾 脏. 3讨论 移植细胞的活体示踪在干细胞研究中起着不可代替的 作用.目前细胞标记方法主要有荧光标记(如PKH26t",DiIt, CFSE,DAPID]等),BrdU标记[,磁标记[,Y染色体法[l及基 因标记法r7]等.BrdU法存在只能标记增殖期细胞,标记细胞 不能直接观察等不足.染色体标记主要将雄性供体动物细胞 移植到雌性动物体内,通过Y染色体杂交区别确认移植细 胞.基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材,使 被标记细胞携带GFP等 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因.但报告基因在目的细胞中 高效稳定表达存在程序繁琐,实验周期长,费用高等缺点. DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,因为DAPI 可以透过完整的细胞膜,可用于活细胞和固定细胞的染色. DAPI标记细胞由于操作简便,被标记细胞生命活动无明显影 响,可以直接观察,费用低廉,因此得到广泛使用.培养的骨 髓间充质干细胞呈梭形,漩涡状生长.7,10d可传代.3代生 长5d可达融合.流式细胞仪表面标志鉴定显示,四代骨髓间 充质干细胞表面标志CD31,CD45呈阴性,CD44,CD71, CD105呈阳性.对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化,经Von kossa染色呈阳性.采用STZ成功建造糖尿病大鼠模型.体外 实验结果表明,DAPI起初标记率很高(接近100%),1周内, 可维持85%,90%标记率.但随着标记时间的延长,其标记效 率迅速下降.3周以后绝大多数DAPI阳性细胞丢失.DAPI标 记率迅速降低的原因,我们推测主要是细胞分裂的影响.由' 于DNA半保留复制的特点,随着细胞分裂,与DNA结合的 DAPI不断被平分到子代细胞中,以致胞内DAPI含量过低无 法被测出.本实验体内示踪过程中,移植1周后,DAH阳性 MSCs在肾脏,胰腺组织中存在.因此,我们认为DAPI标记细 胞可用于2周以内的短期实验,而进行3周以上的MSCs移 植实验,还需要选择其他长效标记方法(PKH26,GFP一标记 等). 参考文献 1EzquerFE,EzquerME,ParrauDB,eta1.Systemicadministration ofmuhipotentmesenchymalstromalcellsrevertshype~ycemia andpreventsnephropathyintype1diabeticmice.BiolBlood MarrowTransplant,2008,14(6):631-640. 2SegersVFM,Riet1V,AndriesLJ,eta1.MesenchymalStemcell adhesiontocardiacmicmvascularendothelium:activatorsand mechanisms.AmJPhysiolHeartCirePhysiol,2006,290:1370- 1377. 3ZhangN,LiJ,LuoR,eta1.Bonemarrowmesenchymalstemcells 中国药物与临床2009年8月第9卷第8期 ChineseRemedies&Clinics,August2009,Vo1.9,No.8 induceangiogenesisandattenuatetheremodelingofdiabetic cardiomyopathy.ExpClinEndocrinolDiabetes,2008,116(2): 1O4一l11. 4MunozJR,StoutengerBR,RobinsonAP,eta1.Humanstempro— genitorcellsfromboneImirrowpromoteneurogenesisof endogenousneuralstemcellsinthehippocampusofmice.PNAS, 2005(102):18171—18176. 5AmsalemY,MardorY,FeibergMS,eta1.Iron-oxidelabelingand outcomeoftmnsplantedmesenchymalstemcellsintheinfarcted myoeardiumCireulation.2007.116:38.H45. 6UrbanVS,KissJ,Kov~csJ,eta1.Mesenehymalstemcells cooperatewithbonemarrowcellsintherapyofdiabetes.Stem Cell,2008,26:244-253. 7RaimondoS,PennaC,PagliaroP.eta1.Morphologicalcharacte- rizationofGFPstablytransfectedadultmesenehymalbone marrowstemcells.JAnat,2006,208(1):3—12. (收稿日期:2008—11-17) 芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病所致 慢性心力衰竭的实验研究 李彦红王风芝 扩张型心肌病(DCM)目前在全世界范围内逐渐增多,且 病残及病死率很高.传统抗心力衰竭治疗及近年来B受体阻 滞剂,血管紧张素转换酶抑制剂的使用仍然达不到很好效 果.芪苈强心胶囊通过强心,利尿,扩血管及抑制肾素一血管 紧张素一醛固酮系统(RAS)改善血流动力学,缓解心力衰竭症 状,减轻左室重构,达到标本兼治的效果.本研究旨在通过观 察芪苈强心胶囊对DCM心力衰竭大鼠心功能的影响,为临 床应用提供理论依据. 1材料与方法 1.1DCM心力衰竭模型制作 参照Shah等…的方法,腹腔注射阿霉素2.5mg/kg,每周 3次,用1周,间隔2周,再用1周,共计6次,总剂量15mg/ kg.末次注射完成后,观察4周. 1.2研究对象及分组 l8只Wistar大鼠.随机分为健康组,心力衰竭组和芪苈 强心胶囊组(芪苈组),每组6只.芪苈组予芪苈强心胶囊药 粉1s/ks.1次,d灌胃,健康组和心力衰竭组予生理盐水灌 胃,共1个月. 1.3观察指标 1.3.1血清脑钠肽(BNP)测定:所有动物治疗前后留取空腹 静脉血1.5IIll,静置30min以上,3000r/min离心15min后 取血清.置于一7O?保存待测.BNP测定采用双抗夹心酶联免 疫吸附试验(ELISA)法.试剂盒购自上海轩昊科技发展有限 公司. 1.3.2心功能测定:所有动物治疗结束后用20%乌拉坦麻 醉,经右颈总动脉插管入左心室,连接血流动力学微机分析 系统测定左室功能.代表收缩功能指标有:左室收缩压 (LVSP)和左室内压力最大上升速率(dp/dt~);代表舒张功能 作者单位:030001太原,山西医科大学第二医院心内科 通信作者:王凤芝 指标有:左心室舒张末压(LVEDP)及左室内压力最大下降速 率(Ldp/dt~). 1.3.3心肌重塑的检测:心功能测定完毕,将大鼠称取体质量 (Bw)后处死,留取心脏标本,测定全心质量(Hw)和左室质量 (Lw),分别计算全心质量指数(HWmW)及左室质量指数(LW/ BW).取左室心肌组织,进行常规苏木素一伊红(HE)及VG染 色.分别观察心肌坏死程度及纤维化程度.根据Biasing~:准 将心肌坏死分为4级.VG染色观察间质纤维化程度:记分标 准:"一"多个视野未见间质胶原纤维,"+"偶见散在短的间质 胶原纤维;"++"间质胶原纤维呈长条索状;"+++"间质胶原纤 维相互连成网状. 1.3.4电镜:在心脏离体30S内取左室心尖部组织,切成约1 mm大小组织块.放人2%的戊二醛中固定2h后,换为1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液.4oC保存送检. 1.4统计学方法 计量资料以?s表示,采用SPSSI2.0软件对数据进行分 析.P<O.05为差异有统计学意义.组间比较采用单因素方差 分析,心肌坏死程度和间质纤维化比较用秩和检验. 2结果 2.1BNP结果:见表1. 表1各组BNP结果比较(;)ps/ml 注a与健康组比较P<O.05;与治疗前比较P<O.05;与心力衰竭 组比较P<O.05 2.2心功能结果:心力衰竭组LVSP和dp/dp~均较正常组 降低,说明模型制作是成功的.具体结果见表2. 2.3BW,HW/BW和LW/BW结果:见表3.