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Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较(可编辑).doc

Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较…

wang萍w
2017-10-10 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较(可编辑)doc》,可适用于生产运营领域

Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较(可编辑)Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较杨桂兰郭学平Lowry改良的酚试剂法(简称Lowry法)和Bradford染料结合法(简称Bradford法)是两种常用的蛋白质测定方法。在用于测定玻璃酸中作为杂质的蛋白质的含量时,发现两种方法的测定结果差异很大。本文用实验和有关文献对此进行分析。材料考马斯亮蓝G,分析纯,上海化学试剂站进口分装牛血清白蛋白(BSA),中国药品生物制品检定所碱性蛋白酶,丹麦Novonordisk公司玻璃酸钠(HA),山东福瑞达精细化工有限公司。紫外可见光分光光度计,日本岛津公司。方法,Lowry法精密称取HAmg,置于ml量瓶中,加水溶解至刻度,依法测定。,Bradford法考马斯亮蓝试液配制考马斯亮蓝mg溶于乙醇ml,再加磷酸ml,加水稀释至ml,过滤备用。标准曲线制作取BSAmg,精密称定,置于ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,制得μgml的BSA对照品溶液。取具塞试管支,分别加入BSA标准液、、、、、ml,均补加水至ml,得到含BSA、、、、、μg的标准系列。分别加入考马斯亮蓝试液ml,立即混匀,min后在nm波长处用cm比色池测定吸收度,以BSAPDFcreatedwithpdfFactorytrialversion>质量(μg)对吸收度作图,得标准曲线,或计算出直线回归方程。供试品测定取HAmg,精密称定,置于ml量瓶中,加水溶解至刻度,取ml于具塞刻度试管中,以下同项下测定吸收度,从标准曲线得到蛋白质质量(μg),以此计算HA供试品的蛋白质含量。Bradford法测定HA溶液中蛋白质的回收实验取BSAmg,精密称定,溶于的HA溶液ml中。再用HA溶液稀释成含BSA、、、μgml的溶液。以HA溶液为空白,用Bradford法测定BSA溶液的蛋白质浓度。BSA水溶液酶解前后蛋白质含量的测定取BSAmg,精密称定,加水溶解至ml。取ml,用稀氢氧化钠溶液调pH,加mgml的碱性蛋白酶溶液ml,酶解h,期间维持pH~。分别取酶解前后的BSA溶液ml于ml量瓶中,加水至刻度,用两种方法分别测定蛋白质的含量。结果HA供试品中蛋白质的含量Lowry法标准曲线的回归方程式为:CA,r。Bradford法标准曲线的回归方程式为:CA,r。式中A为吸收度,C为显色试管中蛋白质的质量μg,r为相关系数。根据两种方法的标准曲线斜率之比可计算出,Bradford法对BSA的显色灵敏度约是Lowry法的两倍。两种方法所测HA供试品中的蛋白质含量见表。Lowry法测定结果明显高于Bradford法。表HA供试品中的蛋白质含量测定值()(n)PDFcreatedwithpdfFactorytrialversionHA供试品号Lowry法Bradford法Bradford法在HA溶液中测定蛋白质的回收率实验结果Bradford法的回收实验结果(见表)表明,在HA溶液中该法测定蛋白质的回收率在左右,符合方法学要求。同时本结果还证实,HA对Bradford法无干扰。表Bradford法测定BSA的回收率nBSA浓度μgml实测值μgml回收率BSA溶液酶解前后的蛋白质含量Lowry法测定BSA溶液酶解前后的蛋白质含量分别为、μgmlBradford法测定BSA溶液酶解前后的蛋白质含量分别为、μgml,结果截然相反。酶解后Lowry法的测定值略有升高,而Bradford法的测定值大幅度下降。讨论测定HA供试品中的微量蛋白质杂质含量时,Lowry法的测定值显著高于Bradford法,可能有两个原因,即不同的测定反应机制和供试品中作为PDFcreatedwithpdfFactorytrialversion主要成分HA的干扰。回收率实验结果排除了后一种原因。Lowry法测定值高,是其反应机制所决定的。该法所用的Folin酚试剂,与酚反应呈现出蓝色,进行蛋白质测定时,该试剂与酪氨酸和色氨酸等特定的氨基酸残基作用,产生显色反应。Lowry等在Folin酚试剂法的基础上,加入了双缩脲法的优点,进行了改良。双缩脲法是利用碱性硫酸铜试液中的Cu与肽键络合而产生的显色反应。两种显色机制的协同作用,使Lowry改良的Folin酚试剂法,显色强度提高~倍,灵敏度为双缩脲法的倍。由此机制可以看出,Lowry法对蛋白质和分子较小的多肽,具有同样的显色反应。本研究用对BSA溶液酶解前后进行蛋白测定的试验证实了这一点,而对于Bradford染料结合法,酶解后测定值下降至约,说明多肽对Bradford法基本无干扰作用。实验中加入的酶只占BSA的,而两种方法所加酶量相等,故酶本身与结果对比,基本无影响。Lowry法和Bradford法的比较见表。HA供试品中含有混合蛋白质和多肽等杂质,用Lowry法测定蛋白质时,多肽也有显色反应,故测定值偏高。多肽的分子链比蛋白质短,一般无致敏作用,而测定HA产品中微量蛋白质的主要目的是将蛋白质含量控制在限量之下,根据被测物质中蛋白质为少量成分时,应选用Bradford法的原则,以及上述试验结果,作者认为测定HA产品中的微量蛋白质,选用Bradford法更适合。使用BSA作为蛋白质测定用对照品应注意下述问题。所用BSA应有足够的纯度,不含脂质、无机盐和非蛋白氮化合物,低温保存,使用前应用五氧化二磷对其进行真空干燥。可用光吸收法,对BSA的纯度或称量精度进行PDFcreatedwithpdfFactorytrialversion

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