酵母转化常用培养基及程序.doc

酵母转化常用培养基及程序.doc 酵母实验操作 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 一(质粒酶切及线性化 1)用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2)线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒 70μl 内切酶(SacI， SalI， Bgl?) 2μl 10 x buffer 8μl 3)酶切3,16小时，一般3小时即可; 二(乙醇回收酶切质粒 1)2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC(PH 5.2)，混匀，沉淀DNA; 02),20C数个小时(>2小时)，13,200rpm离心10,20分钟，吸弃上清; 3)300ul 70,乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清(注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸 取); 4)37?烘干水分和残留乙醇; 5)用20μl ddHO重溶; 2 6)1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量; 三(电转化 1(准备感受态细胞 01)5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，30C，摇菌24 hours; 02)100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，30C ，250rpm，7,8hours，直到OD,1.3,1.5; 60003)菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，4C离心5 min，弃上清; 4)100ml冰水重悬，同上离心，弃上清; 5)80,90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清; 6)20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清; 007)约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，4C备用，剩下的感受态细胞可以保存在,70C冰箱大约3周。 2(转化 1)100μl GS115感受态细胞加入，20μl 线性化质粒，用枪打匀; 2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴; 3) 电转化，参数设定:电压 1500V 电容 25μF 电阻 200欧姆，放电时间 4,5ms 4)立即加650μl 冰 1M sorbitol 入转化杯，打匀; 5) 迅速涂板，250μl/块 MD板，共3块; 06) 涂好的板放在30C培养箱中培养4,5天，至菌落直径1mm即可。 注: 34a)【】内为手册推荐量，相关文献报道，转化效率一般为10,10 / ugDNA，所需质粒量0.3,10ug不等; b)放电是可好出现电击穿现象，原因有:酵母浓度不够;DNA溶液离子浓度过大;混合液体积不够; c)MD板加入1M sorbitol ，转化时第2)步冰浴时间延长至1,2小时，均有利于提高转化效率 四(G418筛选多拷贝基因 1)取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10,20个菌落先 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达; 2)第一块加入2ml 灭菌的ddHo，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块; 2 3)第二块加入1ml，洗之，吸入第三块; 4)菌液吸入EP管，可适量补充ddHo; 2 5)混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50,200ul每块G418板，G418浓度从0.25,4.0mg/ml各一块; 6)注意涂布均匀，可适量补充ddHo， 2007)30C烘箱培养，2,5day，其余菌液可4C保存 注: 7a)手册推荐方法:第4)步将菌液转入EP管中，振荡5,10秒，用分光光度计测菌体密度，1OD600,5×10 cells/ml, 5取一定体积稀释至200ul/每块G418板, 涂布,10 cells;注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。 五(表达: 01)从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，30C，250rpm，2天左右至OD,2,6，颜色乳白; 2)取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管; 3)每隔24小时加千分之五甲醇; 4)至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析; 5)表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀; 6)上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，Western Blotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等 附录一 培养基 LB: Tryptone 10g 1% Yeast Extract 5g 0.5% NaCl 5g 0.5% 【Agar】 15g 1.5%(固体培养基另加) dHO稀释至1L，高压灭菌 2 YPD: Yeast Extract 10g 1% Peptone 20g 2% 【Arga】 20g 2,(固体培养基另加) dHO 900ml 2 高压灭菌，冷却至60度，加 10×Dextrose 100ml YPD,G418: 250ml YPD加10×Dextrose后加适量G418，注意轻摇混匀，不要产生气泡，同时留空白对照板。 终浓度(mg/ml) 1.0 2.0 3.0 4.0 G418储液体积(ml) 2.5 5.0 7.5 10.0 MD: YNB 3.4g 0.34% 【Sorbitol】 182.2g 1M 【Agar】 15-20g 1.5%-2% dHO 800ml 2 高压灭菌，冷却至60度，加 10×(NH)SO 100ml 1% 424,5 500×biotin 2ml 4×10, 10×Dextrose 100ml 1, MGY: YNB 3.4g 0.34% dHO 800ml 2 高压灭菌，冷却至60度，加 10×(NH)SO 100ml 1% 424 10×Glycerol 100ml 1% ,5 500×biotin 2ml 4×10, BMMY: Yeast Extract 10g 1% Peptone 20g 2% YNB 3.4g 0.34% K2HPO4 3.013g KH2PO4 11.813g (PH6.0 缓冲液) dHO 900ml 2 高压灭菌，冷却至60度，加 10×(NH)SO 100ml 1% 424 每次使用之前，分装后加2/1000体积 ,5 500×biotin 2ml 4×10, 连接产物的质粒转化 01),70C取出Top10感受态细胞，50ul/管，取出后迅速分装城10ul或20ul/管; 2)冰浴30min; 03)42C，30秒(精确计时)，置于冰水1,2min; 04)加等体积37C预热的SOC培养基; 05)37C，225rpm，培养45min; 06)100ul分别涂板，37C培养; 酵母转化常用培养基: 1、10*YNB(无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4?保存 2、500*B(0.02%生物素)，生物素20mg/100ml水，4?保存; 3、10*D(20%葡萄糖)，200GD-葡萄糖溶于1L水，过滤灭菌，4?保存 4、10*GY(10%的甘油)100ml甘油溶于900ml水，过滤灭菌，4?保存 5、100*AA(含每种氨基酸0.5%)，称取L-谷氨酸L-蛋氨酸L-亮氨酸L-异亮氨酸L-赖氨酸各500mg 溶于100ml水过滤灭菌，4?保存 酵母培养基 YPD完全培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) 酵母提取物 10g/L 蛋白胨 20g/L 葡萄糖 20g/L 琼脂 15g/L 转化培养基RDB:(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine)100mL 超纯水 80ml 山梨醇 18g(186g/L) 琼脂糖2g(20g/L) 121?灭菌20分钟，待温度将至60?以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖) 10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml 100*AA(含每种氨基酸0.5%)1ml.混匀，倒平板。 选择培养基MD:(Minimal Dextrose Medium+ Histidine)100mL 向80 mL 超纯水中加入琼脂糖2g(20g/L) 121?灭菌20分钟，待温度将至60?以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖)10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml，混匀，倒平板。 选择培养基MM:(Minimal Methanol+ Histidine )100mL 向90 mL 超纯水中加入琼脂糖2g(20g/L) 121?灭菌20分钟，待温度将至60?以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B(0.02%生物素)0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。 诱导表达培养基BMGY (1L)(Buffer Glycerol-complex Medium) 酵母提取物 10g/L 蛋白胨 20g/L KHPO3g/L 24 KHPO11.8G/L 24 超纯水 890Ml 121?灭菌20分钟，待温度将至60?以后，在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B(0.02%生物素)1ml，甘油10mL 诱导表达培养基BMMY (1L)(Buffer Methanol-complex Medium) 酵母提取物 10g/L 蛋白胨 20g/L KHPO3g/L 24 KHPO11.8G/L 24 超纯水 895Ml 121?灭菌20分钟，待温度将至60?以后，在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B(0.02%生物素)1ml，5mL甲醇 电击杯处理: 用超纯水洗干净，检测，5.1以上，用无水酒精浸泡，大约1-2小时，超净台抽干，盖盖，放于-20?备用。 电击仪操作:电源—程序4—2funal—5 (酵母) 电源—程序4—1b….—enter(细菌) 电击转化: 1 取80ul感受态放入10ul含有5-20ug的线型DNA中,然后放入0.2cm冰预冷的电击杯中，混匀，静止5分钟。 2电击转化 3转化完之后，立即放入1mL冰冷山梨醇 4取200-400ul涂板，在RDB平板。 5 ??30 感受肽细胞制备: 试剂制备:制备感受肽应提前预定离心机，并将温4? YPD培养基: 山梨醇1mol/L: 离心管50ml 大枪头5ml 无菌水 1 挑取酵母受体菌的单菌落接种于10mlYPD培养基中，30?摇床过夜。 2 以1 %接种量转接100mlYPD液体培养基，30?摇床过夜至OD=1.3-1.5。 3 4?离心5000rpm,5min,弃上清。 4 用100ml冰预冷无均水将菌体重悬。 5 4?离心5000rpm,10min,弃上清。 6 用50ml冰预冷无均水将菌体重悬。 7 4?离心5000rpm,10min,弃上清。 8 再用20ml 1 mol/L的山梨醇洗涤1次 溶于200ul 1mol/L的冰预冷的山梨醇，以备转化